[發(fā)明專(zhuān)利]β-1,4-內(nèi)切殼聚糖酶(Aus CsnA)基因的克隆及重組酶的制備

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110410463.1
• 申請(qǐng)日: 2011-12-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102392035A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄔敏辰;胡蝶;史紅玲;陳忠法;李劍芳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/56
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/56;C12N9/42;C12N15/10;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/66;C12R1/84
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001菌株的一種糖苷水解酶75家族的殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆，殼聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組殼聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

殼聚糖(chitosan)，又叫脫乙酰幾丁質(zhì)、可溶性幾丁質(zhì)、聚甲殼糖、甲殼胺、聚氨基葡萄糖等，是幾丁質(zhì)脫去乙酰基而得到的產(chǎn)物，通常幾丁質(zhì)的脫乙酰度超過(guò)70％時(shí)就叫殼聚糖。殼聚糖廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲(chóng)外殼以及菌類(lèi)、藻類(lèi)的細(xì)胞壁中，但由于殼聚糖分子量大，水溶性差，在人體內(nèi)不易吸收，使其應(yīng)用受到限制；而經(jīng)殼聚糖降解得到的殼寡聚糖不僅具有水溶性好，易吸收等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)更發(fā)現(xiàn)其還具有許多獨(dú)特的生理活性和功能性質(zhì)。殼聚糖酶能夠降解完全脫乙酰化的殼聚糖，其應(yīng)用前景尤其在食品、醫(yī)藥、保健品方面倍受矚目。?

根據(jù)殼聚糖酶降解部分乙酰化殼聚糖的作用方式分為三類(lèi)：一種切割G1cNAc-G1cN鍵和G1cN-G1cN鍵，另一種只切割G1cN-G1cN鍵，第三種同時(shí)可以識(shí)別G1cN-G1cNAc鍵和G1cN-G1cN鍵，這三種方式協(xié)同作用，將部分脫乙酰化的殼聚糖降解成為聚合度不同的殼寡聚糖。從酶的分類(lèi)學(xué)上講，殼聚糖酶屬于O-糖苷水解酶(O-Glycosidehydrolases，EC3.2.1)，根據(jù)已知的殼聚糖酶氨基酸序列，殼聚糖酶分屬其中的5類(lèi)：46，75，80，8和5家族。其中從細(xì)菌和放線(xiàn)菌中發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶大都屬于46家族，而真菌源的殼聚糖酶則屬于75家族，兩族之間沒(méi)有同源性，說(shuō)明真菌殼聚糖酶在進(jìn)化起源上與細(xì)菌殼聚糖酶不同。目前關(guān)于殼聚糖酶的研究主要集中在細(xì)菌和放線(xiàn)菌中，有關(guān)來(lái)源于真菌宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)的殼聚糖酶基因(Aus?csnA)的克隆和表達(dá)等的研究未見(jiàn)有報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種宇佐美曲霉E001菌株新型殼聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列克隆，殼聚糖酶工程菌的構(gòu)建以及重組殼聚糖酶的高效表達(dá)和純化的方法。生物信息學(xué)分析表明，來(lái)源于宇佐美曲霉E001菌株的一種新型殼聚糖酶屬于糖苷水解酶第75家族，命名為Aus?CsnA，其相應(yīng)的基因命名為Aus?csnA。Aus?CsnA具有較高的催化活性和熱穩(wěn)定性，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種源自宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001菌株新型Aus?CsnA基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。獲取完整mRNA和DNA序列的流程如圖1所示。?

A.usamii?E001菌株由江南大學(xué)篩選和保藏，已于2005年在《食品與發(fā)酵工業(yè)》雜志的Vol.31，No.4，Pg.50公開(kāi)，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。?

所述的由完整mRNA序列推導(dǎo)的Aus?CsnA氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3。?

所述的重組Aus?CsnA的活性測(cè)定方法：?

于25mL具塞試管A和B中，各加入用pH?5.0、檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為0.5％的膠體殼聚糖溶液2.4mL，50℃預(yù)熱10min，在A管中加入0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃準(zhǔn)確反應(yīng)20min；立即各加入2.5mL?3′，5′-二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補(bǔ)加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷卻后各加去離子水5mL，搖勻；540nm處以B管為空白對(duì)照測(cè)定A管吸光度值，并從氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)的還原糖(以氨基葡萄糖計(jì))含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義：在本測(cè)定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)殼聚糖酶活性單位(U)。?

所述的Aus?csnA完整mRNA和DNA序列的克隆和表達(dá)方法：?

(1)Aus?csnA?3′端mRNA序列的克隆：首先對(duì)Aspergillus?fumigatus(GenBank?AAO41660)、Aspergillus?oryzae(GenBank?BAA92250)和Aspergillus?terreus(GenBank?XP_001209034)GH75的殼聚糖酶序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出兩段約8個(gè)氨基酸的保守序列；再對(duì)該兩段氨基酸序列的mRNA進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)兩條正向簡(jiǎn)并引物Csn-F1和Csn-F2。?