[發明專利]AusMan5A-TviCBM融合酶基因的構建及表達

無效

• 申請號: 201110410434.5
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102492675A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;唐存多;李劍芳;陳忠法;趙順閣
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N1/19;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種底物親和力強、催化效率高的AusMan5A-TviCBM融合酶，其核苷酸和氨基酸序列分別為SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2。

2.嵌合酶工程菌的構建和表達方法：

(1)CBM數據庫的建立：根據Carbohydrate-Active?enZYmes?Database(http://www.cazy.org/)中收錄的信息，選取CBM1(主要是纖維素結合結構域)成員建立一個CBM數據庫，并收錄與Km值有關的文獻；

(2)CBM與底物的對接和分子動力學模擬：選取有代表性的幾個CBM分別與底物用AutoDock4.2軟進行分子對接，然后用GROMACS進行分子動力學模擬，最終選取綠色木霉甘露聚糖酶的CBM融合到Aus?Man5A的羧基端；

(3)嵌合酶基因及其表達質粒的構建：基于上面設計的嵌合酶基因序列，采用重疊PCR技術將Aus?Man5A的基因序列與CBM的核苷酸序列融合。重疊PCR涉及到的兩對引物分別為：

AMan5A-F：GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC，待融合的宇佐美曲霉Aus?Man5A的基因片段的上游引物；

AMan5A-R：TTGTACCGCCGGCACTATCAATAGCAGCAA，待融合的宇佐美曲霉Aus?Man5A的基因片段的下游引物；

Tman5A-F1：TGATAGTGCCGGCGGTACAACCACTCC，待融合的CBM基因片段的上游引物；

Tman5A-R：GCGGCCGCTCATGTATTCAGGCATTGCG，待融合的CBM基因片段的下游引物；

采用重疊PCR技術構造融合基因man5A-cbm，主要分為四步：以AMan5A-F和AMan5A-R為引物進行第一輪PCR(94℃4min；30個循環，94℃30s，53℃30s，72℃1min；72℃10min)合成待融合的宇佐美曲霉Aus?Man5A的基因片段；以Tman5A-F1和Tman5A-R為引物進行第二輪PCR(94℃4min；30個循環，94℃30s，53℃30s，72℃1min；72℃10min)合成待融合的CBM基因片段；將兩輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶，分別純化后混勻，在無引物的條件下進行第三輪PCR(94℃4min；10個循環，94℃30s，52℃30s，72℃70s；72℃10min)；以第三輪PCR反應液為模板，以AMan5A-F和Tman5A-R為引物進行第四輪PCR(94℃4min；30個循環，94℃30s，53℃30s，72℃70s；72℃10min)。將第四輪PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T-man5A-cbm)，轉化JM109，經酶切鑒定正確后送上海生工測序。將測序正確的pUCm-T-man5A-cbm與pPIC9K質粒均用EcoR?I和Not?I進行雙酶切，回收的酶切產物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pPIC9K-man5A-cbm，并對重組表達質粒進行序列測定；

(4)GS115/man5A-cbm的構建、表達、產物純化及活性測定：用Sal?I對pPIC9K-man5A-cbm進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/man5A-cbm；該基因工程菌用1.0％甲醇誘導表達96h，采用DNS法測得發酵液中甘露聚糖酶活性達65IU/mL；發酵液經離心后的上清液為嵌合酶的粗酶液，該粗酶液經截留分子量為10,000Da的超濾膜濃縮，再經DEAE-Sepharose?Fast?Flow離子交換層析和Sephadex?G-75凝膠過濾層析純化，純化后經SDS-PAGE檢測為單一條帶。