[發明專利]東亞砂蘚組織培養過程中配子體消毒方法

有效

• 申請號: 201110410348.4
• 申請日: 2011-12-12
• 公開（公告）號: CN102405844A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 沙偉;張梅娟
• 申請（專利權）人: 齊齊哈爾大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 齊齊哈爾鶴城專利事務所 23207
• 代理人: 葉仲剛

技術領域

本發明屬于苔蘚植物組織培養技術，確切地說是涉及東亞砂蘚組織培養過程中配子體的消毒方法。

背景技術

目前，苔蘚植物中的小立碗蘚在國外已成為研究植物分子生物學的理想實驗材料和研究基因功能的模式植物，土生墻蘚還成為研究耐旱蘚類生理生態和抗旱機理的主要模型。然而與之形成鮮明對比的是國內外有關于紫萼蘚科植物的研究報道在卻少之又少，為了填補這一空白，我們開展了東亞砂蘚配子體再生體系建立方法的課題研究，雖然整個研究過程都進展得比較順利，并取得了理想的實驗效果，然而在研究中我們也遇到了這樣一個問題，就是在我們的部分培養試驗中所得到的東亞砂蘚配子體再生體系很不穩定，通過分析發現其主要原因是出在培養過程中的消毒環節。據此我們曾采用了許多種常規的消毒方法進行彌補，但是其效果都不夠理想，因為苔蘚植物的配子體與大多數高等植物不同，它是由單層細胞組成的，消毒不徹底染菌率高，消毒過度會褐化死亡，對消毒液的種類、濃度、消毒時間等許多因素都很難把握。多年來有關用配子體作為實驗材料的報道之所以特別少見，苔蘚植物配子體的消毒困難顯然是其中的一個主要原因，通過長時間不斷的探索，我們終于取得了突破性的進展，本發明就是對于這項內容所做的具體總結。

發明內容

本發明的目的在于提供一種適合于東亞砂蘚配子體的消毒方法，以克服組織培養過程中無法利用孢子體、配子體消毒難的問題。

本發明公開的東亞砂蘚組織培養過程中配子體的消毒方法按以下步驟：

（1）取培養一段時間后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成小段，放到空的培養瓶中，用紗布蓋好，放在水龍頭下用自來水沖洗幾小時；

（2）用洗潔精溶液浸泡10min左右，于流水下沖洗30min左右，于無菌水中沖洗數次；

（3）在超凈工作臺上用無菌濾紙吸干材料表面水分，放入0.01%-0.1%的升汞溶液中消毒15s-60s；

（4）用無菌水反復沖洗7-8次，無菌濾紙吸干表面水分，接種于MS培養基上。

所述方法中需挑選粗壯、長勢好的東亞砂蘚，剪成長度為0.5-1cm的小段。

所述方法中浸泡用的洗潔精溶液濃度為1%-2%。

所述方法中滅菌處理用0.02%的升汞處理配子體45s。

本發明消毒方法在解決苔蘚植物的配子體方法方面取得了重要的進展，這一成功為東亞砂蘚配子體再生體系建立方法的課題研究提供了重要的支持和保證。雖然從技術方面看并不十分復雜，但是卻成功地解決了一項長期困擾該項課題的一大難題，克服了以往苔蘚植物組織培養中主要以孢子體作為原始材料的弊端，填補了現有技術的空白。本發明消毒方法效果特別好，消毒后的配子體污染率低，損傷率小。同時，本發明消毒方法還有操作簡單，成本低，省時省力等優點。

具體實施方式

本發明東亞砂蘚組織培養過程中配子體的消毒方法，包括如下步驟：

1．試驗材料：試驗材料采自于黑龍江省五大連池風景區石龍，現保存于齊齊哈爾大學生命科學與農林學院標本室，編號為20090627。將材料采回后進行培養，選取長勢較好的用于實驗。

2．試驗方法

（1）器材：試驗中所用到的鑷子、剪刀、培養皿、組培瓶等器材均經過高壓蒸汽滅菌法121℃滅菌30min。

（2）培養基的滅菌：所用培養基為MS培養基。采用高壓蒸汽滅菌法121℃滅菌15min。

（3）配子體的消毒：選取長勢較好的東亞砂蘚配子體，自頂端往下依次剪成小段，放到空的培養瓶中，用紗布蓋好，放在水龍頭下用自來水沖洗幾小時；再用洗潔精溶液浸泡10min左右，同時設置對照：不用洗潔精溶液浸泡，流水下沖洗30min左右，于無菌水中沖洗數次，轉入超凈工作臺。在超凈工作臺上用無菌濾紙吸干材料表面水分，放入0.01%-0.1%的升汞溶液中消毒15s-60s。不同消毒處理如下：

a）0.01%????15s、30s、45s、60s

b）0.02%????15s、30s、45s、60s

c）0.05%????15s、30s、45s、60s

d）0.10%????15s、30s、45s、60s

（4）接種：將消毒完后的材料于無菌水中反復沖洗7-8次，每次至少停留1min鐘以上，盡可能洗掉殘留的升汞，減少對配子體的損害。每個處理重復3次。

（5）培養：將材料接種于MS培養基上，放入T=20±2℃、光照12h/12h、光強3000-5000lux光照培養箱中進行培養，每天觀察其生長情況。