[發明專利]將顯微鏡載物臺經調節安裝于顯微鏡座上的裝置和方法

有效

• 申請號: 201110410141.7
• 申請日: 2011-12-09
• 公開（公告）號: CN102608746A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: R·塞弗特
• 申請（專利權）人: 徠卡顯微系統復合顯微鏡有限公司
• 主分類號: G02B21/26
• 分類號: G02B21/26
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 蔡民軍

技術領域

本發明涉及將顯微鏡載物臺經調節安裝于顯微鏡座上的裝置和方法。

背景技術

近期，光學顯微技術不斷得到發展，基于對單個點狀體特別是熒光分子的連續、隨機的定位，可以對比傳統光學顯微鏡的與衍射相關的分辨率極限要小的圖像結構進行成像。這些技術描述在例如下述文件中：WO2006/127692A2；DE102006021317B3；WO2007/128434A1；US2009/0134342A1；DE102008024568A1；M.J.Rust，M.Bates，X.Zhuang在2006年第3期《自然方法》的793-796頁中公開的“Sub-diffraction-limit?imaging?by?stochastic?optical?reconstruction?microscopy(STORM)”(《由隨機光學重建顯微術(STORM)進行亞衍射極限成像》)；Geisler?C.等人在《應用物理A刊》88卷的223-226頁(2007年)中公開的“Resolution?of?Lambda/10?in?fluorescence?microscopy?using?fast?single?molecule?photo-switching”(《使用快速單分子影像轉換在熒光顯微術中λ/10的分辨率》)。這一顯微術的新分支也被稱為定位顯微術。人們在有關文獻中已能知道上述應用技術，例如，學名為(F)PALM[(熒光)光敏定位顯微術]，PALMRA(自動探測型光敏定位顯微術)，GSD(IM)[基態損耗(單分子折返)顯微術]或者(F)STROM[(熒光)隨機光學重建顯微術]的技術。

這些新方法的共同特征在于待成像的結構事先經過標記物的處理，這些標記物具有可以區分的兩種狀態，即“亮”態和“暗”態。例如，當用熒光染料作標記物時，亮態就是這些染料發出熒光的狀態，暗態就是這些染料不發出熒光的狀態。為了以超出光學成像系統的傳統分辨率極限的分辨率成像圖像結構，標記物的一個小的子集被反復轉變成亮態，也就是所謂的受激發狀態。在這種情況下，受激發的子集的選擇要能夠使處于亮態的相鄰標記物的平均距離比光學成像系統的分辨率極限大。受激發子集的亮度信號被成像到空間分辨光探測器上，例如一種電荷耦合器件(CCD)攝像機。因此，探測每個標記物的光點，該光點的大小由光學成像系統的分辨率極限決定。

通過這種方式，可以俘獲若干個原始數據的單幀，在每個單幀中對不同的受激發子集進行成像。然后，使用圖像分析方法，在每個原始數據的單幀中，確定光點的矩心，其中矩心代表處于亮態的那些標記物。在此之后，將由原始數據的單幀確定的光點矩心結合成為總代表圖。由該總代表圖產生出的高分辨率圖像反映標記物的分布情況。為了代表性地再現待成像結構，必需探測足夠的信號。然而，由于受激發子集中的標記物數目受限于兩個處于亮態的標記物的最小平均距離，為了完全地對該結構進行成像，必需俘獲相當數量的原始數據的單幀。一般，原始數據的單幀的數目在10000至100000內。

俘獲一個原始數據的單幀所需要的時間有一個下限，該下限由成像探測器的最大圖像俘獲速率預先決定。這使得俘獲總代表圖所需的系列原始數據的單幀的總的時間相對較長。由此，總俘獲時間可以長達幾個小時。

在這較長的總俘獲時間內，待成像的樣本可能會相對于光學成像系統發生移動。為了形成高分辨率的總圖像，在確定矩心之后，將所有原始數據的單幀結合，而在對原始數據的單幀兩次連續俘獲期間，樣本與光學成像系統之間的每次相對運動都會有害于總圖像的空間分辨率。在很多情況下，這種相對運動是由該系統的系統性機械運動造成的，也被稱為機械漂移。例如，熱膨脹或者收縮、機械應變或者用在機械組件上的潤滑劑均勻度的變化等都可以成為該運動產生的原因。

在前述的高分辨率技術中，如何保證構成成像系統的物鏡相對于置于臺面板上的樣本不發生定位漂移是至關重要的問題。為了實現這一要求，可以將物鏡直接安裝到臺面板，而不是像通常那樣安裝于物鏡旋轉器。通過這種設計，物鏡被設置在背離樣本的臺面板下側、處于在臺面板中形成的通孔區域中，對放置在臺面板上側的樣本架中的樣本通過該通孔成像。由于物鏡直接安裝于臺面板，使得物鏡與樣本架的機械耦合路徑變得相對較短。因此，很大程度上防止在物鏡與樣本架之間產生機械漂移。

然而，當物鏡被直接安裝到顯微鏡載物臺的時候，此時物鏡與顯微鏡座的光軸的對齊變得相對復雜。例如，每次將顯微鏡載物臺從顯微鏡座卸下，例如為了維修目的，都必需將顯微鏡載物臺相對于顯微鏡座再次調節。這不僅費力而且容易出錯。