[發明專利]一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體及其制備方法

無效

• 申請號: 201110407260.7
• 申請日: 2011-12-09
• 公開（公告）號: CN102558353A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 龔鋼明;何婷婷;高然
• 申請（專利權）人: 上海應用技術學院
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C07K16/06;C12N9/06;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 吳寶根

1.一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體，其特征在于通過如下方法制備：

（1）、大腸桿菌基因組DNA的提取

按Omega公司細菌基因組DNA提取試劑盒的使用方法提取大腸桿菌基因組DNA；

所述的大腸桿菌為BL21（DE3）；

（2）、目的基因NrfA的PCR擴增

上游引物為CGGGATCCATGACAAGGATAAAAATAAACG；

下游引物為GGCCTCGAGTTATTGGCTTAACAGACC；

以步驟（1）提取的大腸桿菌基因組為模板，通過PCR擴增目的基因片段，PCR反應條件為：94℃預變性4min；94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30個循環；72℃延伸10min，得PCR擴增產物；

（3）、重組質粒pET-28a（+）-NrfA的構建

將（2）所得的PCR擴增產物經BamHⅠ和XholⅠ分別在GGATCC、CTCGAG位點雙酶切，回收目的片段NrfA，與經同樣酶切并回收后的pET-28a（+）表達載體在10?×T4?連接酶緩沖液中采用T4?DNA?連接酶進行連接，連接產物再轉化大腸桿菌E.coli?TG1細胞，得到重組質粒pET-28a（+）-NrfA；

（4）、NrfA蛋白的表達、純化

將步驟（3）所得的重組質粒pET-28a（+）-NrfA轉化大腸桿菌BL21（DE3）進行表達，挑取單克隆培養后，所得的陽性克隆培養物以2%接種量接種于卡那霉素含量為50mg/ml的LB培養基，37℃搖床培養至對數生長期，加入終濃度為1mmol/l的IPTG進行誘導，37℃、220r/m搖床培養4h；離心收集菌體，菌體經pH7.4的PBS洗滌三次，超聲波裂解細胞，離心收集沉淀；

沉淀依次經洗滌液Ⅰ、洗滌液Ⅱ、溶解液III分別洗滌三次，每次轉速6000rpm，最后得到的沉淀部分即為粗NrfA目的蛋白；

所述的洗滌液Ⅰ為50mmol/L?Tris-HCl，1mmol／L?EDTA?,1%?TrionX-100?，pH8.0；

所述的洗滌液II為20mmol/L?Tris-HCl，1mmol／L?EDTA，4mol/?L尿素，pH8.0；

所述的洗滌劑III為50mmol/L?Tris-HCl，1mmol／L?EDTA，8mol/?L尿素，?5mmol／Lβ-巰基乙醇，pH8.0；

??????將粗NrfA目的蛋白經超濾管離心超濾脫去脲素即得NrfA目的蛋白；

（5）、多克隆抗體的制備

將步驟（4）所得的NrfA目的蛋白經pH7.4的PBS溶液調整，使其終濃度為0.2mg/ml，再以1：1比例與弗氏完全佐劑混合，常規方法免疫新西蘭雄兔1次，按同樣方法，1：1比例與弗氏不完全佐劑混合，再免疫雄兔2次，然后頸動脈取血，分離血清，即得到一種大腸桿菌NrfA基因表達蛋白多克隆抗體。