[發明專利]一種梅花莖尖染色體制片方法

有效

• 申請號: 201110406925.2
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102564821A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 張啟翔;陳晶鑫;羅樂;楊冰潔
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及植物染色體制片方法，具體涉及梅花莖尖染色體制片方法。

背景技術

梅花(Prunus?mume?Sieb.et?Zucc.)是重要的觀賞花木，其遺傳育種方面的研究發展迅速。然而由于梅花染色體小，其染色體層面的研究極其局限。

經過現有文獻記載，梅的染色體數目據國外Okabe(1927，1929)報道是2n＝16，24。Oginuma等(1987，1989)發表是2n＝16。在國內，主要是黃哲(1989)首次對梅花的染色體進行了研究；黃燕文，包滿珠等(1995)對野梅、果梅和花梅染色體的數目及形態進行了研究；林盛華、褚孟嫄(1999)對梅花染色體進行了研究，鑒定梅品種資源的倍數性，為梅分類起源和遺傳育種提供細胞學依據。他們所采用的主要是涂片法和壓片法，其技術體系中存在一些問題：各個處理時間不確定，制片技術耗時等；同時，取材受限于早春梅花發葉之前，取材時間短，時間受限。

另外，染色壓片技術所制的的染色體標本，尤其是卡寶染色，一方面由于染色，破壞了染色體結構，無法進行更高層次的熒光原位雜交實驗，另一方面，在實驗初期的低溫掀片過程中，會損失大量分裂相，不利于實驗的進行。因此，只能用于常規觀察及初步核型分析，無法通過熒光原位雜交進行精確核型分析。

發明內容

本發明提供一種梅花莖尖染色體制片方法。

本發明提供的梅花生長點染色體制片方法，其為選取梅花一年生枝條頂端生長點或經修剪后新發出的頂端生長點最內側的長度為0.5～1.0cm的部分，依次進行卡諾固定液固定、前低滲處理、纖維素酶和果膠酶的酶解、后低滲處理，將處理后的頂端生長點進行火焰干燥法制片。

其中，所述的所述的火焰干燥法制片包括如下步驟：切取莖尖基部，解剖針搗碎，平攤于載玻片上，用鑷子剔除雜質，滴卡諾固定液，載玻片置于酒精燈火焰上方，待載玻片上卡諾固定液燃燒，移開載玻片，直至載玻片干燥。

其中，取材時間優選為上午9:00～11:00。

其中，前低滲處理溶液優選為0.075mol/L的KCl，處理時間優選為30min。

其中，用纖維素酶和果膠酶的酶溶液常溫酶解1h～2h，其中，所述酶溶液中，纖維素酶的濃度為2.0～2.5％，果膠酶的濃度為2.0～2.5％。

其中，用ddH₂O進行后低滲處理，處理時間30min。

本發明采用火焰法制片，省去預處理過程，直接固定，提高制片效率，拉長了染色體長度。此外，更重要的是解決了取材受限于早春的問題。本發明通過早春修剪梅花枝條，獲得生長旺盛的生長點，用于制片。本發明還明確了各個處理環節的時間控制，找到了最佳的梅花染色體制片技術。克服了以往的梅花染色體制片技術在處理時間過于籠統，操作性不強的問題。同時，火焰干燥法沒有染色和壓片過程，這樣在熒光原位雜交過程中避免了染色體結構遭到破壞，并免去了低溫掀蓋玻片過程，能夠完好保存所有分裂相，保證良好的分裂相用于后期雜交實驗。

附圖說明

圖1：‘黃綠萼’一年生枝條生長點40倍鏡檢(火焰干燥法)。

圖2：‘扣子玉蝶’一年生枝條生長點40倍鏡檢(火焰干燥法)。

圖3：‘扣子玉蝶’一年生枝條生長點，100倍油鏡鏡檢(壓片法)。

圖4：‘黃綠萼’一年生枝條生長點100倍油鏡鏡檢(壓片法)。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1

梅花品種(‘黃綠萼’)，于早上9:00，取一年生植株頂端生長點。直接使用卡諾固定液，低溫4℃固定20h；固定后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，轉移至0.075mol/LKCl溶液中，進行前低滲30min；將前低滲處理后的頂端生長點用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，再用纖維素酶和果膠酶的酶溶液(纖維素酶0.25g，果膠酶0.25g，蒸餾水10g)進行酶解1h50min；酶解后，用蒸餾水潤洗，吸水紙吸干，使用ddH₂O進行后低滲，低滲時間為30min；切取莖尖基部，解剖針搗碎，平攤于載玻片上，將雜質用鑷子剔除，滴固定液，于酒精燈上烤片。后在光學顯微鏡下觀察。

鏡檢效果：在40倍顯微鏡的情況下，有20％的細胞分裂相，染色體清晰可見，可以計數，長度適宜，這些細胞位置分布較為均勻。經計數，梅花染色體2n＝16(圖1)。

實施例2