[發明專利]熱穩定性提高的脂肪酶突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 201110406922.9
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102660517A
• 公開（公告）日: 2012-09-12
• 發明（設計）人: 馮雁;謝淵;楊廣宇
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

技術領域

本發明涉及生物技術，具體涉及一種熱穩定性提高的脂肪酶突變體及其構建方法。

背景技術

脂肪酶(Lipase)是一種用途十分廣泛的生物催化劑，不僅可催化油脂在水相中的水解，也能在非水相中催化酯合成、轉酯等反應，常被用于洗滌劑添加劑、食品、制藥工業、造紙工業和生物能源等方面。其中，南極假絲酵母脂肪酶B是目前最為有效的生物催化劑之一，廣泛用于藥物的手性拆分及生物柴油的生產(Kirk?O，Anderson?EM，Karin?M(1998)One?biocatalyst-many?applications：The?use?of?Candida?antarctica?b-lipase?in?organic?synthesis.Biocatal?Biotransform?16(3)：181-204)。但是工業生產所需的苛刻條件和酶穩定性之間的矛盾，長久以來一直在制約著脂肪酶的發展和應用。如為了保證催化效率，許多反應需要在較高溫度下進行，而南極假絲酵母脂肪酶B屬于中溫脂肪酶，它的熱穩定性差不僅限制了其應用范圍，而且使酶易于失活，增加了生產成本。因此，獲得一株熱穩定性提高的脂肪酶具有重要的工業應用價值。

半理性設計是一種結合了理性設計和定向進化兩方面優勢的方法，其主旨在于構建小而有效的突變庫。目前，半理性設計已成功用于改變酶的底物特異性、熱穩定性、對映體選擇性等，并取得了顯著的成績(Reetz?MT，Carballeira?JD，Peyralans?J，Hobenreich?H，Maichele?A，Vogel?A(2006a)Expanding?the?substrate?scope?of?enzymes：Combining?mutations?obtained?by?casting.Chemistry-a?European?Journal?12(23)：6031-6038.Reetz?MT，D?Carballeira?J，Vogel?A(2006b)Iterative?saturation?mutagenesis?on?the?basis?of?b?factors?as?a?strategy?for?increasing?protein?thermostability.Angewandte?Chemie-International?Edition?45(46)：7745-7751.Reetz?MT，Prasad?S，Carballeira?JD，Gumulya?Y，Bocola?M(2010)Iterative?saturation?mutagenesis?accelerates?laboratory?evolution?of?enzyme?stereoselectivity：Rigorous?comparison?with?traditional?methods.J?Am?Chem?Soc?132(26)：9144-9152)。

我們首先利用已知的信息進行分析，找出可能的“熱點”，再對這些“熱點”進行飽和突變，構建突變文庫；然后選擇合適的載體和宿主進行表達；最后對文庫進行篩選得到性質改變的突變體。再以此突變株作為模板，重復上述過程，直至變體達到所預期的要求。

大腸桿菌表達系統具有遺傳背景清楚，目的基因表達水平高，培養周期短，抗污染能力強等特點，是分子生物學研究和生物技術產業化發展進程中的重要工具。在前期工作中，發明人已成功將南極假絲酵母脂肪酶B在大腸桿菌中進行了高效表達。本發明以大腸桿菌作為宿主細胞，利用半理性設計的方法，獲得了熱穩定性顯著提高的脂肪酶突變體。

發明內容

本發明的目的，在于提供一種熱穩定性提高的脂肪酶突變體及其構建方法。本發明的脂肪酶突變體已于2011年11月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。其分類命名為：大腸埃希氏菌，拉丁名：Escherichia?coli。其中，突變體Asp223Gly的保藏編號為CGMCC?No.5390，突變體Leu278Met的保藏編號為CGMCC?No.5389，突變體Asp223Gly/Leu278Met的保藏編號為CGMCC?No.5387，野生型WT的保藏編號為CGMCC?No.5388。