[發明專利]嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建及其酶的應用

無效

• 申請號: 201110406838.7
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102559567A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 馮雁;田東升;楊廣宇;安嬌;謝淵;白挨璽
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N9/42;D21C9/00;C12P19/14;A23K1/165;D01C1/00;C12G3/02;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 楊元焱

1.一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌，含有嗜熱內切木聚糖酶基因核苷酸序列SEQ?ID?NO：1。

2.如權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于所述嗜熱內切木聚糖酶基因來源于熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725)。

3.如權利要求1所述的一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于對所述的嗜熱內切木聚糖酶基因的核苷酸序列SEQ?ID?NO：1之上進行突變、改造或修飾。

4.如權利要求1所述的一種嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725)的培養

按照DSMZ的配方配置厭氧培養基，按照100體積份的厭氧培養基注入1體積熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725)的比例，將熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725)接種到厭氧培養基中進行培養；

B、基因組DNA的提取

將步驟A培養的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725)用細菌基因組DNA提取試劑盒提取熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor?bescii?DSM?6725)的基因組，得到基因組DNA溶液；

C、引物設計及用PCR法釣取嗜熱內切木聚糖酶目的基因

引物設計如下：

上游引物：5’CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA?3’，劃線部分為Nco?I的酶切位點；

下游引物：5’CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC?3’，劃線部分為Xho?I的酶切位點；

以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進行PCR反應，得到PCR擴增產物，再對擴增產物進行純化，得到純化的PCR產物，然后用限制性內切酶Nco?I和Xho?I進行雙酶切，得到嗜熱內切木聚糖酶目的基因；

D、構建重組表達載體

以pET28a為載體，對載體用限制性內切酶Nco?I和Xho?I進行雙酶切，然后用連接試劑盒與步驟C所得嗜熱內切木聚糖酶目的基因進行連接，得到重組表達載體；

E、將重組表達載體轉化到宿主細胞中

將步驟D所得重組表達載體轉化到大腸桿菌B?L?21感受態細胞中進行培養，得到嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌。

5.如權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，其特征在于：所述的PCR反應的反應體系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer?star)1μl，DNA聚合酶緩沖液(Primer?star?buffer)20μl，作為模板的基因組DNA溶液2μl，2.5mM脫氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超純水至總體積100μl；所述的PCR反應的反應程序為：94℃預變性3min；然后98℃變性15s，60℃退火10s，72℃延伸90s，再72℃延伸20min，共30個循環；所述的PCR反應的反應程序為：94℃預變性3min；然后98℃變性15s，56℃退火10s，72℃延伸90s，最后再72℃延伸20min，共32個循環。

6.如權利要求1所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，其特征在于：步驟C所述的用限制性內切酶Nco?I和Xho?I進行雙酶切的酶切體系包括：40μl純化的PCR產物，上游引物和下游引物各2μl，限制性內切酶緩沖液(FD?buffer)4.9μl。

7.如權利要求2所述的嗜熱內切木聚糖酶基因工程菌的構建，其特征在于：所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。