[發(fā)明專利]一種重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110405033.0
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102392041A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張偉;辛渝;李樹剛;于廷和;但國平;龔會英;柴新娟;李曉麗;曹莉君;張勇
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶科潤生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 重慶志合專利事務(wù)所 50210
• 代理人: 胡榮琿

1.一種重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的制備方法，有以下步驟：

1）根據(jù)人CRF氨基酸序列設(shè)計(jì)并合成人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子基因；

2）步驟1）所得基因通過聯(lián)接肽、腸激酶識別位點(diǎn)與適宜載體中的Trx蛋白融合，得到表達(dá)載體pET32-CRF；

3）步驟2）所得的表達(dá)載體pET32-CRF轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)獲得重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子工程菌pET32-CRF/BL21(DE3)；

4）步驟3）得到的重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子工程菌PET32-CRF/BL21(DE3)經(jīng)發(fā)酵、純化步驟，制備出Trx-CRF融合蛋白；

5）步驟4）得到的Trx-CRF融合蛋白經(jīng)腸激酶切割后，分離純化獲得重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟2）所述表達(dá)載體的構(gòu)建方式為：-Trx-聯(lián)接肽-DDDDK-CRF-，其中-DDDDK-為腸激酶識別位點(diǎn)，D為天冬氨酸，K為賴氨酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：腸激酶識別位點(diǎn)的N端的連接肽結(jié)構(gòu)為-(GGGGS)n-，其中G為甘氨酸，S為絲氨酸，n為0-10。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述n為3。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放基因的N端序列為SEEPPI-，其中S為絲氨酸，E為谷氨酸，P為脯氨酸，I為異亮氨酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟5）所述的重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的DNA序列如SEQ?ID?NO:1所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟5）所述的重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的對應(yīng)編碼氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟4）所述發(fā)酵是將重組人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子工程菌pET32-CRF/BL21(DE3)接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，通過加入IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟4）所述純化的步驟包括離心收集菌體，破菌、離心收集破菌液上清，將收集上清上Chelating?Sepharose?Fast?Flow螯合層析，洗去雜蛋白，洗脫目的融合蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟5）所述分離純化是將酶切后的產(chǎn)物上Chelating?Sepharose?Fast?Flow螯合層析，去雜蛋白，洗脫目的蛋白。