[發明專利]一種血漿中利可君濃度的檢測方法

有效

• 申請號: 201110405011.4
• 申請日: 2012-01-30
• 公開（公告）號: CN103226142A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 謝少斐;韓亮;范婧;霍立茹;楊曉兵;余麗麗;曾瀅
• 申請（專利權）人: 南京長澳醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種血漿中利可君濃度的檢測方法，特別涉及一種采用液相色譜-質譜聯用技術分析利可君濃度的方法。

背景技術

利可君為升白細胞藥，用于預防和治療各種原因引起的白細胞減少、再生障礙性貧血及血小板減少癥等，化學名為：2-（α-苯基-α-乙氧羰基-甲基）噻唑烷-4-羧酸。

????對利可君的藥理活性研究已有許多，但是生物樣品中利可君的濃度測定及其藥代動力學研究報道卻沒有。

另外，利可君存在3個手性中心，有多個手性中心，因此，提供一種可靠的可檢測所有這些異構體的方法就成為積極困難的事情。

發明內容

本發明要解決技術問題是，克服現有技術的缺陷，提供一種簡單、快速、靈敏的測定血漿中利可君血藥濃度的方法。

????本發明提供了一種血漿中利可君濃度的檢測方法，包含以下步驟：

?(a)對血漿樣品進行前處理：取待測樣品，加入內標和高氯酸進行蛋白沉淀，并取上清液，所述的內標為替硝唑，其用量為使樣品中含替硝唑濃度為100ng-1mg/ml，所述的高氯酸溶液的用量為每1ml樣品中加入高氯酸重量為10-100mg。

?(b)采用液相色譜-質譜（LC-MS）聯用儀測定上述上清液中利可君的濃度，其中，LC-MS聯用的色譜條件是：色譜柱是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；內標法，以替硝唑作為內標；流動相為乙腈-水-冰乙酸的混合液，其體積比例范圍為20±1:80±5:0.3±0.03）；LC-MS聯用的質譜條件是：離子源為ESI離子源，正離子檢測。

所述步驟(a)中高氯酸可預先配置成水溶液，濃度為1-10%，優選為3-7%，最優選為4%。

所述步驟(a)中替硝唑可預先配置成水溶液，濃度為1.0-1.5μg/ml。

所述的分析血漿中利可君含量的方的檢測方法，色譜條件流動相由乙腈-水-冰乙酸組成，其配比為乙腈-水-冰乙酸=20:80:0.3。

所述的的檢測方法，其特征在于，步驟LC-MS聯用質譜條件中，掃描方式為選擇性離子檢測。

上述色譜條件為典型條件，實際應用中根據所使用儀器的不同特點，可以對各參數做出適當調整，以期獲得最佳的效果。本發明建立了簡單、靈敏、快速的LC-MS法測定血漿中利可君的濃度，其高靈敏度、較小的樣品需求量以及相對較短的分析時間使得本發明方法適用于利可君的臨床前和臨床藥代代動力學研究，利用該方法，可以很好的分離檢測利可君及其非對映異構體。???????

附圖說明

圖1為利可君的結構式。

圖2A為利可君的質譜全掃描圖。

圖2B為替硝唑的質譜全掃描圖。

圖3A-3C為實施例一中利可君和替硝唑的總離子流色譜圖，Ⅰ代表替硝唑的色譜峰，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分別代表利可君的四種非對映異構體；其中：圖3A代表空白血漿；圖3B代表空白血漿中加入利可君和內標替硝唑；圖3C代表血漿樣品。

圖4A-4C為另一實施例中利可君和替硝唑的總離子流色譜圖，Ⅰ代表替硝唑的色譜峰，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分別代表利可君的四種非對映異構體；其中：圖4A代表空白血漿；圖4B代表空白血漿中加入利可君和內標替硝唑；圖4C代表血漿樣品。

具體實施方式

實施例一

????1?儀器、材料與試劑

????1.1?儀器??LC-MS聯用儀（島津LC-MS2020）

????1.2?樣品與試劑?利可君（純度為＞99.5%）；替硝唑（純度＞99.8%），購自中國藥品生物制品檢定所；其他化學試劑均為分析純。

????2?實驗部分

????2.1?血漿樣品前處理?取靜脈注射給藥后采集的大鼠血漿樣品100μL置于1.5mL塑料Ep管中，加入30μL內標溶液(1140ng/mL)，渦旋混合30s，再加入100μL4%高氯酸溶液，渦旋混合3min，4℃條件下20000rpm離心10min兩次，取上清液10μL進行LC-MS分析。

????2.2?LC-MS分析條件

????2.2.1?色譜條件?色譜柱：Agilent?ZORBAX?Eclipse?Plus?C18?(2.1*150mm,?5-Micro)；流動相：乙腈:水:冰乙酸=20;80;0.3；柱溫：30℃；流速：0-4min為0.3mL/min，4-5min由0.3mL/min線性升至0.6mL/min，維持0.6mL/min至分析時間結束；進樣量：10μL。