[發明專利]一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法

無效

• 申請號: 201110404508.4
• 申請日: 2011-12-08
• 公開（公告）號: CN102382800A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 歐陽紅生;逄大欣;朱建國;周楊;高飛;唐成程;全龍泉;張明軍
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

技術領域

本發明公開一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，將豬胚胎成纖維細胞轉化脂肪細胞，屬于細胞誘導技術領域。

背景技術

由于臨床治療的需要，人們需要特殊分化的細胞來治療疾病，所以干細胞誘導及分化技術逐漸成熟，但隨之發現，一些細胞能夠不通過干細胞狀態直接分化成另一種類型的分化細胞，所報道的方法都是以轉基因的手段來實現的，直接將終末分化的細胞轉化為其他類型的功能細胞：如將胚胎成纖維細胞、成軟骨細胞和視網膜上皮細胞轉變為具收縮特性的肌細胞；將Β淋巴細胞轉變為巨噬細胞；將胰島外分泌細胞轉化為β胰島細胞樣細胞；將小鼠成纖維細胞轉化為功能性的神經細胞；將小鼠心肌內成纖維細胞重新編程為心肌細胞來修復受損的心臟。由于誘導細胞編程都是以轉基因為主，其轉基因后導致的外源基因插入突變對生物安全性有嚴重的影響，并且該方法獲得的細胞在疾病治療或者器官移植中都是不可用的，這就導致了目前的方法只適用于研究而不適用于臨床治療。

目前，對脂肪細胞分化及調控方面的研究主要使用體外分化系統。現在已經建立起來的最有代表性的兩個前脂肪細胞系是Green和Kehinde從17－19天小鼠胚胎的中胚層多能干細胞中分離并誘導分化出來的，即3T3-F442A和3T3-L1小鼠前脂肪細胞系，當用適當的誘導劑進行誘導刺激時，約經過一周左右的時間就可分化成為充滿著脂肪滴的脂肪細胞。如利用該方法得到脂肪細胞，就必須預先分離得到前脂肪祖細胞，這就使得獲得脂肪細胞的難度大大增加，并且前脂肪細胞在動物體內含量較少且不易分離純化，所以人們通常使用前脂肪細胞系由于研究，但其作為一種成系細胞，具有一定的致瘤性，并不適用于疾病治療。

發明內容

本發明提供一種細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，通過細胞信號通路抑制劑作于細胞，獲得的豬脂肪細胞沒有外源基因的插入，解決了轉基因后導致的外源基因插入突變對生物安全性影響的問題。

本發明的技術解決方案如下：

將豬胚胎成纖維細胞以4~6×10⁴個/?cm²的比例均勻的接種到Corning細胞培養板中，使用誘導培養基培養；37℃，5％CO₂培養箱中培養20天時，對細胞進行觀察并油紅O染色，可發現油紅O著色細胞，證明其確實為脂肪細胞；

誘導培養基配方為：15%（v/v）Knockout?Serum?Replacement?(Invitrogen)血清，82.8%（v/v）DMEM/F12(Invitrogen)培養基，0.1mM非必須氨基酸(Invitrogen)，0.055mMβ-巰基乙醇(Invitrogen)，2?mM?L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.2-1μM?SB431542?(Stemgent)。

所述細胞信號通路抑制劑誘導豬脂肪細胞形成的方法，還可加入0.5-2μM通路抑制劑Thiazovivin后使其效率增加。

細胞信號通路抑制劑SB431542和Thiazovivin分別作用于TGF-β/smad信號通路和ROCK信號通路。Smad3能夠與通過C/EΒPβ的Mad?homology?1區域的結合，影響C/EΒPβ與DNA的結合，從而抑制其活性，抑制脂肪細胞轉化。因此通過細胞信號通路抑制劑SB431542的處理，可以抑制TGF-β/smad信號通路的活性，促進脂肪細胞的形成。而ROC家族成員能夠直接調節細胞骨架中的肌動蛋白進行重組，還能夠調節如細胞能動性、粘附力、胞質分裂等多種與肌動蛋白細胞骨架相關的細胞功能。ROCK介導的Rho信號肽是通過磷酸化某些參與肌動蛋白絲組裝及收縮的底物來調節肌動蛋白細胞骨架的。而在脂肪形成的過程中絲狀的肌動蛋白結構發生改變，從長的張力纖維變成皮質肌動蛋白。因此抑制ROCK信號通路可促進脂肪細胞的形成。

本發明的積極效果在于：利用細胞信號通路抑制劑而非轉基因來誘導細胞轉化，可有效的防止細胞基因組因插入外源基因而導致的基因突變。同時該方法對于研究脂肪細胞的形成機制有一定的促進作用，其簡便性和安全性可被廣泛的應用，可用于脂肪形成機制的研究，也能在疾病治療等臨床應用上發揮作用。

附圖說明

圖1?為實施例1誘導得到的脂肪細胞；

圖2?為實施例1誘導得到的脂肪細胞油紅O染色；

圖3為實施例1RT-PCR分析脂肪特異基因表達；

圖4?為實施例1細胞免疫熒光染色分析脂肪特異基因表達；

圖5?為實施例2誘導得到的脂肪細胞油紅O染色；