[發明專利]一種大通量鑒定蘇云金芽孢桿菌毒力基因的方法

有效

• 申請號: 201110403701.6
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102409104A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 鄭愛萍;李巧;李平;朱軍;鄧其明;李雙成;王世全
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10;A01N63/00;A01P7/04;C12N15/82;A01H5/00;C12R1/07
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種鑒定蘇云金芽孢桿菌毒性基因的方法及其應用。

背景技術

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididal?crystal?proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農田害蟲、森林害蟲及衛生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。

自1981年Schnepf從菌株HD-1Dipel中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來，人們已經分離克隆了390多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類。一般而言，Cry1，Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應用于植物的鱗翅目害蟲的防治。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(B.thuringiensis?subsp.israelensis，簡稱Bti)產生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運用于蚊蟲的防治。同時，Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性。

由于大規模和反復使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群已相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產生了抗性。上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(M?cGaughey，W.H.1985.Science.229：193-195)，原因主要是持續使用單品種的Bt以及Bt轉基因抗蟲植物的應用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年，McGaughey報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodia?interpunctella)在Dipel(Bt?subsp.kurstaik?HD-1的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt殺蟲劑產生了明顯的抗性(Tabashnik，B?E，et?al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：4120-4124)，上世紀90年代以來，在我國應用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發現Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經形成。目前發現在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產生了抗性，用選擇壓力數學模型預測到，在Bt轉基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產生抗性。

為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。而傳統的尋找新基因的方法幾乎都是基于PCR，常用的方法有多重PCR，PCR-RFLP，Exclusive?PCR，隨機擴增多態性DNA(RAPD)鑒定，核酸分子雜交，基因芯片，蛋白鑒定。這些方法都有其缺點以及不足，例如采用PCR相關方法需要合成大量的引物，對于不同的基因類型需要進行多次的PCR，十分耗時。核酸分子雜交，則需要合成大量的DNA探針等，這些方法對于一些與已發現的基因同源性低，很新的基因不能有效的識別，因此會失去大量的新模式基因。

發明內容

本發明的目的在于針對傳統鑒定新基因方法的不足提供一種新的鑒定Bt毒力基因資源的方法。

本發明的目的還在于提供一種大規模、高通量的獲得Bt毒力基因的方法。

本發明的技術方案如圖1所示。本發明是混合多株Bt菌株的基因組，進行測序，通過測序結果的組裝，結合與數據庫PFAM，GO，KEGG，Trimble的比對結果，提取毒力基因相關的CDS序列，通過NCBI的比對結果對所選的毒力基因相關CDS進行分類，可鑒定出總基因組中所含的基因類型。再根據比對結果設計相應的引物，提取所選菌株的基因組，使用所設計的引物對待測菌株的基因組進行PCR擴增，克隆得到大量的Bt毒力基因。

本發明提供了一種高通量鑒定細菌功能基因的方法，包括以下步驟：

(1)選取在光學顯微鏡或者掃描電鏡下具有伴胞晶體的菌株作為目標菌株，提取質粒和基因組后，混合；