[發(fā)明專(zhuān)利]一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110403007.4
• 申請(qǐng)日: 2011-12-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102417920A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)國(guó)清;李慧娟;王鴻;易喻;梅建鳳;陳建澍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P21/06
• 分類(lèi)號(hào): C12P21/06;C12N11/12
• 代理公司: 杭州天正專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種單克隆抗體片段的制備方法，特別涉及一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法。

(二)背景技術(shù)

人絨毛膜促性腺激素(human?chorionic?gonadotrophin，hCG)是人類(lèi)受孕后胎盤(pán)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白激素，分子量約為38000D，hCG的合成與分泌與妊娠是密切相關(guān)的。hCG的檢查可作為早孕檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，采用抗hCG單克隆抗體進(jìn)行早孕檢測(cè)，可以進(jìn)一步提高早期妊娠診斷的敏感性和特異性。而且hCG的含量與許多腫瘤性疾病有著密切的聯(lián)系，可將hCG看作是腫瘤標(biāo)志物之一，因此hCG的檢查也可對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤和非滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤的診斷與治療監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤如胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等血中hCG也可升高，在患膀胱癌、胰腺癌、結(jié)腸癌的個(gè)體的血清中常可檢測(cè)得到hCGβ亞基蛋白有明顯地提高，而且在腫瘤組織中通過(guò)過(guò)氧化物酶染色法也可以檢測(cè)到。

另外相對(duì)于單克隆抗體，單克隆抗體片段(包括Fab和F(ab′)2片段)具有更多優(yōu)勢(shì)(1)不受位于巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨細(xì)胞等細(xì)胞上的Fc受體的影響；(2)不沉淀抗原；(3)在正常組織中分解放射性標(biāo)記片段比整個(gè)IgG偶聯(lián)物更快；(4)降低免疫原性(Fc區(qū)缺失)，使人抗鼠免疫球蛋白(HAMA)反應(yīng)最小化；(5)更不易遭到吞噬細(xì)胞攻擊；(6)分子量小，到達(dá)腫瘤部位迅速。

因此，若能研制出高純度、效果好、免疫原性弱的人絨毛膜促性腺激素(hCG)單克隆抗體片段，并應(yīng)用與診斷試劑的開(kāi)發(fā)，必將帶來(lái)可觀(guān)的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。

根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及專(zhuān)利報(bào)道，抗體片段的制備，都采用游離的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解抗體再經(jīng)過(guò)多步分離純化制得，該類(lèi)方法存在游離酶無(wú)法重復(fù)利用，去除游離酶同時(shí)會(huì)降低產(chǎn)物回收率等問(wèn)題。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，該方法操作簡(jiǎn)便、純化步驟少、所得抗體片段純度高。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段的制備方法，所述方法為：將含0.1～1mmol/L?DTT和0.1～2.5mmol/L?EDTA的pH5.0～9.0的0.1mol/L醋酸緩沖溶液在30～50℃下水浴5～10min，加入固定化木瓜蛋白酶，30～50℃水浴20～30min，抽濾，棄去濾液A即除去DTT，獲得濾餅A即為活化的固定化木瓜蛋白酶，將活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5.00.1mol/L醋酸緩沖液中，加入抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體，30～60℃水浴反應(yīng)4～24h，反應(yīng)液抽濾，濾餅B為固定化木瓜蛋白酶回收利用，濾液B即為含單克隆抗體片段的水解液，采用弱陰離子交換層析對(duì)含單克隆抗體片段的水解液進(jìn)行分離純化，獲得所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體片段；所述固定化木瓜蛋白酶以氨化紙纖維為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑，以木瓜蛋白酶為底物，于含1mmol/L?DTT和2mmol/L?EDTA的pH5.0的0.1mol/L醋酸緩沖液中，室溫下攪拌8～24h，抽濾，得濾餅C即為固定化木瓜蛋白酶；所述氨化紙纖維是紙纖維先經(jīng)0.1～0.2mol/L的NaOH溶液處理2～3h，再用環(huán)氧氯丙烷于60～70℃活化0.5～1h，最后用對(duì)苯二胺于40～50℃氨化0.5h，用蒸餾水充分洗滌，真空干燥至恒重，獲得氨化紙纖維；所述固定化木瓜蛋白酶質(zhì)量用量以抗體體積計(jì)為0.1～0.2g/ml抗體，所述固定化木瓜蛋白酶載酶量為0.002g/g固定化酶，所述抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體利用辛酸-硫酸銨法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化獲得。

所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制備：將氨化紙纖維分散于含1mmol/L?DTT和2mmol/L?EDTA的pH2.0～6.5的0.1mol/L醋酸緩沖溶液A中，加入木瓜蛋白酶和質(zhì)量濃度25％的戊二醛水溶液，室溫下攪拌8～24h，抽濾，濾餅C用與所述的醋酸緩沖溶液A相同的醋酸緩沖液B充分洗滌，過(guò)濾，濾餅即獲得固定化木瓜蛋白酶；所述氨化紙纖維與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1∶0.006，所述25％戊二醛水溶液以氨化紙纖維質(zhì)量計(jì)為0.317ml/g，所述醋酸緩沖溶液A的體積用量對(duì)本發(fā)明沒(méi)有影響，能夠使紙纖維充分分散即可，體積用量通常以氨化紙纖維的質(zhì)量計(jì)為33～40ml/g，所述醋酸緩沖液B的體積用量通常能夠充分洗滌即可。