[發(fā)明專利]一種基于Ipr1基因構(gòu)建的巨噬細(xì)胞異性打靶載體和重組細(xì)胞

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110402670.2
• 申請(qǐng)日: 2011-12-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102517294A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何小寧;張涌;權(quán)富生;王勇勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué);楊凌科元克隆股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/877
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 陸萬(wàn)壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于Ipr1基因構(gòu)建的巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體和重組細(xì)胞。

背景技術(shù)

牛結(jié)核病是由M.bovis引起的一種人畜共患傳染病，在發(fā)展中國(guó)家是牛疾病中最具災(zāi)難性的疾病之一(Berrada?and?Barjas-Rojas，1995)。牛型結(jié)核分枝桿菌主要侵害牛，牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌所引起的一種人畜共患的的慢性傳染病，其病變特征為病牛逐漸消瘦，在組織器官中形成結(jié)節(jié)性肉芽腫和干酪樣壞死。牛結(jié)核病因其易傳染，危害嚴(yán)重，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B類傳染病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物傳染。其傳播流行影響著畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的健康。所以，控制牛結(jié)核病是一個(gè)關(guān)系到控制人類結(jié)核病能否成功的重要因素。但是目前對(duì)結(jié)核病的治療只能采用抗生素治療，如：鏈霉素、卡那霉素等。長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，所以尋求一種新的治療結(jié)核病的方法迫在眉睫。

隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展與完善，為動(dòng)物抗病育種提供了新的思路。體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力(GOO?J，et?al.An?approach?for?producing?transgenic?cloned?cows?by?nuclear?transfer?of?cells?transfected?with?human?alpha?1-antitryp?sin?gene[J].Theriogenology，2006，65(9)：1800-1812.)，該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)移在體細(xì)胞培養(yǎng)階段進(jìn)行，直接利用已確定的整合有目的基因的體細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植(SCNT)，這樣體細(xì)胞核移植前供體細(xì)胞的選擇不但可以提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出生率還可以降低其生產(chǎn)成本(Wheeler?MB，WaktersE?M.Transgenic?technology?and?applications?in?swine[J].Therioge?nology，2001，56：1345-69.)。2006年，美國(guó)科學(xué)家Maga等培育出在乳腺中特異表達(dá)人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊(Maga?EA?et?al.Consumption?of?milk?from?transgenic?goat?expression?human?lysozyme?in?the?mammary?gland?result?in?modulation?of?intestinal?microfluro[J].Transgenic?Res，2006，15：515-519)。2009年，西北農(nóng)林科技大學(xué)生物工程研究所培育出在乳腺中特異表達(dá)人防御素的轉(zhuǎn)基因奶牛。現(xiàn)在對(duì)于體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因和克隆技術(shù)掌握的比較成熟。

2005年pan等發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的發(fā)生是與胞內(nèi)病原體抗性基因1(Ipr1)有關(guān)，該研究證明對(duì)結(jié)核桿菌易感的動(dòng)物是由于機(jī)體沒(méi)有Ipr1表達(dá)，且該基因僅在巨噬細(xì)胞中表達(dá)(Pan?H，et?al.Ipr1gene?mediates?innate?immunity?to?Tuberculosis[J].Nature，2005，434(7034)：767-772)。這為研究防治結(jié)核病提供了新的可能：利用體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞克隆相結(jié)合的方式，使得缺少Ipr1表達(dá)的牛通過(guò)生物技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)Ipr1表達(dá)，以達(dá)到抗結(jié)核病的目的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種基于Ipr1基因構(gòu)建的巨噬細(xì)胞異性表達(dá)載體和重組細(xì)胞，并以構(gòu)建的包含Ipr1巨噬細(xì)胞特異性打靶載體的新生牛耳成纖維細(xì)胞系作為核供體細(xì)胞的，為預(yù)防及控制牛結(jié)核病的傳播和流行奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種重組Ipr1基因，在Ipr1基因的上游連接牛巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子MSR1，構(gòu)成重組基因MSR1-Ipr1。

所述的重組Ipr1基因中，Ipr1基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，MSR1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的重組Ipr1基因，在MSR1的上游連接如SEQ.ID.NO.3所示的同源臂LA，在Ipr1的下游連接如SEQ.ID.NO.4所示的同源臂SA，構(gòu)成重組基因LA-MSR1-Ipr1-SA。

在LA與MSR1之間還設(shè)有兩個(gè)Loxp序列，兩個(gè)Loxp序列之間設(shè)有抗生素正篩選基因。

在通用型打靶載體上克隆重組基因MSR1-Ipr1，并克隆包含牛28號(hào)染色體SP-A與MAT1A基因之間間隔序列的同源臂。