[發明專利]一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法及應用

無效

• 申請號: 201110402593.0
• 申請日: 2011-12-07
• 公開（公告）號: CN102492719A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 陳士云;張勇;楊寶玉
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/31;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體涉及一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法。同時還涉及一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的用途，具體地說，本發明涉及蘇云金芽胞桿菌中群體感應信號分子降解蛋白編碼基因aiiA通過農桿菌轉化煙草，獲得廣譜抗植物病毒的轉基因煙草，對不同種類的重要的植物病毒如煙草花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒等都有較好的抗病毒效果。本發明的技術方法將可廣泛應用于經濟作物的病毒病防治。

背景技術

自然界中，很多植物都會受到病毒侵染而引起病毒病。植物病毒雖是嚴格的細胞內寄生物，但?；圆⒉粡?，往往一種病毒可寄生在不同種、屬甚至不同科的植物上，常常發生復合侵染。幾乎每種農作物和經濟作物都受到幾種甚至十幾種病毒的危害而減產或絕產。植物病毒病是一種全球性的病害，每年全世界由植物病毒病造成的農作物損失難以計數。我國是個農業大國，隨著生態條件的改變和植物種質資源的引進，病毒種類有逐漸增多，危害逐漸加重的趨勢。

病毒在植物細胞內絕對寄生，其復制所需的能量、物質、場所完全由寄主細胞提供，加之植物沒有完整的免疫代謝系統，這使得植物病毒病的防治非常困難。對于植物病毒病害的防治大多使用的是綜合措施，但這些傳統的方法都存在局限性。如對于一些蟲傳病毒可用農藥來殺死傳染病毒的昆蟲，但這種方法所用化學農藥易造成環境污染，而且對病毒感染植物后的病害藥效不顯著。對于適用于無性繁殖的農作物可以組織脫毒法獲得無病毒病的種植材料，但缺點是成本高、工作量大，特別是由于田間的再侵染，維持無毒的有效期不長。近年來植物抗病毒基因工程的誕生為人們防治病毒病帶來了希望。

2000年Dong等從一株芽胞桿菌菌株240B?1中克隆到了編碼降解群體感應(Quorum?sensing)信號分子N-酰基高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine?lactones，AHLs)的蛋白基因aiiA。之后用根癌農桿菌法把該基因轉化煙草、馬鈴薯后，增強了馬鈴薯、煙草對大白菜軟腐病菌(Erwinia?carotovora?SCGl)的抗性。此外還發現AiiA蛋白不僅能提高轉基因植物對病原細菌的抗病能力，還可以提高動物的免疫力。但關于該基因在抗植物病毒方面的功能還沒有相關報道。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法，方法易行，操作簡便，增強對不同植物病毒的廣譜抗性，獲得的轉基因植物可以增強對不同植物病毒的抗性，將可廣泛應用于經濟作物的病毒病防治。

本發明的另一個目的是在于提供了一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物在煙草中的應用，該發明的主要優點是對重要的植物病毒都有廣譜的抗病效果，可以應用于主要作物的轉基因抗病毒。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：

一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物的制備方法，其步驟是：

a.轉化載體的構建：

將蘇云金芽胞桿菌(Bacillus?thuringiensis，本單位袁志明研究員惠贈，請見遺傳資源表)的aiiA基因用限制性內切酶酶切后連接到植物雙元轉化載體pA8上(購自CAMBIA公司的pCAMBIA?1305.1載體，簡稱為pA8載體，請見遺傳資源表)，通過凍融法將連接好的植物雙元轉化載體pA8-aiiA轉入農桿菌菌株(Agrobacterium?tumefaciens)EHA105(美國普渡大學S.Gelvin教授惠贈，請見遺傳資源表)中。

b.植物遺傳轉化：

通過葉盤轉化方法(參考Horsch?et?al.，1985)分別轉化珊硒煙草(Nicotiana?tabacum?cv.Xanthi)和本生煙草(N.benthamiana)，在含有潮霉素的MS培養基(MS+1.0mg/L?BA+0.1mg/L?NAA+30mg/L?Hygromycin+100mg/LTimentin)上篩選獲得轉化苗，通過生根培養基(MS+0.1mg/LNAA+30mg/LHygromycin+100mg/L?Timentin)獲得完整的再生植物，包括轉化空載體的pA8再生植物以及轉化pA8-aiiA的再生植物。

本發明發現將蘇云金芽孢桿菌的aiiA基因通過農桿菌轉入煙草中表達，可獲得廣譜抗植物病毒的轉基因煙草。

一種廣譜抗植物病毒的轉基因植物在煙草中的應用，其應用過程如下：