[發(fā)明專利]一種可用于Real Time-PCR擴(kuò)增鏈霉菌DNA的特異性引物

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110400009.8
• 申請(qǐng)日: 2011-12-06
• 公開（公告）號(hào): CN102399895A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李順鵬;鄭婕;陳俊輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種可用于Real?Time-PCR擴(kuò)增鏈霉菌DNA的特異性引物。

背景技術(shù)

鏈霉菌(Streptomyces)是一種地理分布和寄主范圍均很廣泛的放線菌，主要在土壤和腐敗的植物中發(fā)現(xiàn)，大部分鏈霉菌會(huì)產(chǎn)生孢子，是重要的腐生物，并且會(huì)使土壤產(chǎn)生土腥味。鏈霉菌屬于Actinobacteria，大概550種鏈霉菌已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并且不斷有新種被發(fā)現(xiàn)。

鏈霉菌家族對(duì)人類的一個(gè)重要貢獻(xiàn)就是產(chǎn)生各種抗生素。鏈霉素、四環(huán)素、和紅霉素等都是由它們產(chǎn)生的。鏈霉菌在土壤中可以忍受極端的環(huán)境。科學(xué)家從測(cè)出的基因組序列中發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌擁有大量基因以適應(yīng)不同的環(huán)境，其中大約1

2％的基因是負(fù)責(zé)打開或者關(guān)閉其他基因。抗生素的濫用給細(xì)菌施加了強(qiáng)大的自然選擇壓力，測(cè)定鏈霉菌的基因組可以幫助制造更有效的抗生素，在某種程度上克服細(xì)菌的抗藥性。只有少部分的鏈霉菌是病原體，主要是植物病原體，感染植物根系，例如Streptomyces?caviscabies，Streptomyces?acidiscabies，也會(huì)使馬鈴薯得馬鈴薯瘡痂病。Streptomyces?somaliensis和Streptomyces?sudanensis感染人體后會(huì)得足分支菌病。

目前，擴(kuò)增鏈霉菌的特異引物擴(kuò)增的片段大多為500bp或者更大，不利于應(yīng)用到Real?Time-PCR定量的檢測(cè)樣品中的鏈霉菌。對(duì)于分布廣泛和功能強(qiáng)大的鏈霉菌，如果能設(shè)計(jì)特異性的引物，運(yùn)用Real?Time-PCR技術(shù)定量檢測(cè)樣品中鏈霉菌的豐度，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研究和實(shí)際應(yīng)用，有很大的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決目前缺乏引物從樣品DNA中以Real?Time?PCR擴(kuò)增出鏈霉菌靶標(biāo)序列的問題，而提供一種用于擴(kuò)增鏈霉菌的特異性引物。

一種用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物，其正向引物SF序列如SEQ?IDNo.1所示，反向引物SR序列如SEQ?ID?No.2所示。

所述的用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物在鏈霉菌的分子檢測(cè)中的應(yīng)用。

所述的用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物在制備鏈霉菌檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明的引物是根據(jù)鏈霉菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異和Real?Time-PCR的引物要求設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物SF/SR可從各類含有鏈霉菌的樣品DNA中直接快速擴(kuò)增出長(zhǎng)度為200bp的鏈霉菌目的片段。可以應(yīng)用于Real?Time-PCR，可以快速定量檢驗(yàn)土壤中鏈霉菌。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中SF/SR引物對(duì)5種屬細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。M泳道為標(biāo)準(zhǔn)BM2000，1號(hào)泳道為含有鏈霉菌(Streptomyces)菌株DNA的擴(kuò)增結(jié)果，2-5號(hào)泳道分別為含有枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis，)、鞘脂單胞菌(Sphingomonadales)、紅球菌(Rhodococcus，)、伯克氏菌(Burkholderia，)DNA的擴(kuò)增結(jié)果，6號(hào)泳道為不含DNA空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。

圖2為實(shí)施例2中SF/SR引物對(duì)土壤樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。M泳道為標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1-4號(hào)泳道分別為河北廊坊市土壤樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，5-8號(hào)泳道分別為湖北武漢市土壤樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

分別以的鏈霉菌(Streptomyces?ATCC?13273)、枯草芽胞桿菌(Bacillus?subtilis，ATCC?6633)、鞘脂單胞菌(Sphingomonadales，ATCC?27551)、紅球菌(Rhodococcus，ATCC6939)、伯克氏菌(Burkholderia，ATCC?17616)5個(gè)屬細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行引物VF/VR的特異性驗(yàn)證試驗(yàn)。菌種購自ATCC(American?Type?Culture?Collection).

PCR擴(kuò)增體系為：25μL由0.5μL?DNA模板(約10ng)、0.5μL正向引物SF(10μM)、0.5μL反向引物SR(10μM)、0.5μL?dNTPs(10mmol/L)、2.5μL?10×PCR?buffer(with?MgCl2)、0.2μl?TaqDNA聚合酶(5U/μL)，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5min，變性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。