[發明專利]小分子有機物的量子點標記半抗原直接競爭免疫分析方法

無效

• 申請號: 201110399382.6
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN102495204A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 劉曙照;馮大和
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/536
• 分類號: G01N33/536;G01N21/64
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所 32106
• 代理人: 江平

技術領域

本發明涉及小分子有機物（農藥、藥物、環境內分泌干擾物）的納米熒光探針標記半抗原直接競爭免疫分析新技術領域。

背景技術

環境和農畜產品中農藥、藥物、環境內分泌干擾物的殘留超標，對環境和環境生物構成一定威脅，影響食品安全和人類健康。加強環境和食品安全監測，需要高效快速的分析技術。

目前已報道的農藥、藥物、環境內分泌干擾物殘留的檢測方法主要有色譜法和色質聯用法。采用這些方法需要昂貴的儀器設備、專業化的實驗室和訓練有素的專門人才，樣品前處理要求高、過程復雜、速度慢，檢測成本高，特異性不強，難以適應大量樣品和現場快速檢測的要求。現有小分子有機物的酶聯免疫吸附分析（ELISA），通常采用聚苯乙烯微孔板固定抗體或抗原，免疫反應在固相和液相界面進行，需要通過洗滌方式將固、液兩相分離，加入酶的底物進行顯色反應后檢測，步驟多，操作復雜；放射性同位素標記免疫分析方法趨向于淘汰；以有機熒光分子作標記物的熒光免疫分析存在穩定性差、易發生光漂白等問題，與化學發光免疫分析類似，經典的熒光免疫分析容易受背景的干擾。

發明內容

本發明的目的是以高效水溶性量子點作為納米熒光探針，建立一種特異性強、靈敏度高、簡便高效、用于小分子有機物（農藥、藥物、環境內分泌干擾物）快速檢測的量子點標記半抗原直接競爭免疫分析新技術。

本發明的技術方案是：采用混合酸酐法或碳二亞胺法，將激發波長寬、發射波長窄、熒光量子效率高、穩定性好、表面具有活性氨基的核殼結構水溶性量子點與含活性羧基末端的目標分析小分子有機物（農藥、藥物、環境內分泌干擾物）半抗原共價偶聯制備量子點標記半抗原；將對目標分析小分子有機物具特異性親和力的抗體固定在水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，并封閉水分散性聚苯乙烯磁性微球表面未結合所述抗體的位點；將適量固定有抗目標分析物抗體并經過封閉處理的聚苯乙烯磁性微球、目標分析物的量子點標記半抗原和目標分析物標樣在水相中混勻，室溫下進行競爭性免疫反應至平衡，同樣條件下以待測樣品和目標分析物空白代替標樣設置樣品和空白對照反應體系；將平衡后的反應體系在磁場中使聚苯乙烯磁性微球與液相分離，對液相進行熒光檢測；在條件優化的基礎上，依據標樣體系的熒光強度F_S與空白對照的熒光強度F₀之比F_S/F₀與目標分析物濃度在一定范圍內成正比（聚苯乙烯磁性微球上結合的量子點標記半抗原的量與目標分析物濃度在一定范圍內成反比）的規律以及待測樣品的F_S/F₀，計算待測樣品中小分子有機物的含量，建立高靈敏度快速檢測目標分析小分子有機物的量子點標記半抗原直接競爭免疫分析方法。

本發明綜合利用免疫分析特異性強，量子點熒光性能優異、聚苯乙烯磁性微球可在水相中分散且可在磁場中與液相迅速分離等優勢，免疫反應在水分散體系中進行，平衡時間短，省去了洗滌和顯色反應步驟，分析時間約為常規ELISA的1/2~1/4。與常規免疫分析技術相比，本發明所建立的量子點標記小分子有機物（農藥、藥物、環境內分泌干擾物）半抗原直接競爭免疫分析技術特異性強、靈敏度高，方法簡便高效，是對現有小分子有機物免疫分析技術的發展和創新，具有很高的開發應用價值。

附圖說明

圖1為不同氰戊菊酯濃度時液相中的量子點標記半抗原熒光光譜。

圖2為不同諾氟沙星濃度時液相中的量子點標記半抗原熒光光譜。

圖3為不同雙酚A濃度時液相中的量子點標記半抗原熒光光譜。

具體實施方式

一、??量子點標記氰戊菊酯半抗原直接競爭免疫分析技術實施例一：

將氰戊菊酯半抗原????????????????????????????????????????????????????（n=1-5）采用經典的混合酸酐法或碳二亞胺法與表面修飾有活性氨基、熒光發射波長為705nm的水溶性量子點共價偶聯制備量子點標記氰戊菊酯半抗原，以pH8.3、含0.5g/L疊氮化鈉和1mol/L甜菜堿的0.05mol/L硼酸鹽緩沖液定容至1μmol/L（按量子點計），4℃儲存備用。