[發明專利]小分子有機物的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法

有效

• 申請號: 201110399381.1
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN102495210A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 劉曙照;馮大和;劉騰飛
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所 32106
• 代理人: 江平

技術領域

本發明涉及小分子有機物（農藥、藥物、環境內分泌干擾物）的量子點標記抗體均相免疫分析技術。

背景技術

環境和農畜產品中農藥、藥物、環境內分泌干擾物的殘留超標，對環境和環境生物構成一定威脅，影響食品安全和人類健康。加強環境和食品安全監控，需要高效快速的分析技術。

目前已報道的農藥、藥物、環境內分泌干擾物殘留的檢測方法主要有色譜法和色質聯用法。采用這些方法需要昂貴的儀器設備、專業化的實驗室和訓練有素的專門人才，樣品前處理要求高、過程復雜、速度慢，檢測成本高，特異性不強，難以適應大量樣品和現場快速檢測的要求。現有小分子有機物的免疫分析，通常采用聚苯乙烯微孔板作固相載體固定抗體或抗原，在固相和液相界面進行競爭性免疫反應，反應速度慢，需要通過洗滌方式將固、液兩相分離。其中酶聯免疫吸附分析需要加入酶的底物進行顯色反應后檢測，步驟較多且時間較長；放射性同位素標記免疫分析方法趨向于淘汰；以有機熒光分子作標記物的熒光免疫分析存在穩定性差、易發生光漂白等問題，與化學發光免疫分析類似，經典的熒光免疫分析容易受背景的干擾。

發明內容

本發明的目的是：以高效水溶性量子點作為納米熒光探針標記抗目標分析小分子有機物（農藥、藥物、環境內分泌干擾物）抗體，建立一種特異性強、靈敏度高、簡便高效、用于目標分析小分子有機物快速檢測的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析新技術。

本發明的原理和技術方案是：以激發波長寬、發射波長窄、熒光量子效率高、穩定性好的水溶性量子點作為納米熒光探針，采用碳二亞胺法與抗目標分析農藥、藥物、環境內分泌干擾物抗體共價偶聯制備量子點標記抗體；將適量量子點標記抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋成適當濃度，加入含對應目標分析物的標樣，與量子點標記抗體發生均相免疫反應，降低了量子點標記抗體的熒光強度（量子點標記抗體發生熒光淬滅），同樣條件下以待測樣品和目標分析物空白代替標樣，設置樣品和空白對照反應體系；免疫反應平衡后，分別檢測空白對照體系的熒光強度F₀和含對應目標分析物體系的熒光強度F，依據空白對照體系的熒光強度F₀與標樣體系的熒光強度的比值F₀/F的大小（即量子點標記抗體的熒光淬滅程度）與體系中對應目標分析物濃度在一定范圍內成正比的規律，在條件優化的基礎上建立免疫分析標準曲線；根據待測樣品的F₀/F和所述免疫分析標準曲線，計算待測樣品中目標分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測目標分析小分子有機物（農藥、藥物、環境內分泌干擾物）的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法。

本發明綜合利用免疫分析特異性強、量子點熒光性能優異、均相免疫反應速度快、平衡時間短、可直接進行熒光檢測等優勢。與常規免疫分析技術相比，本發明所建立的量子點標記抗體非競爭均相免疫分析方法不僅特異性強、靈敏度高、重現性好，而且更加簡便高效，不需要進行固液分和顯色反應，檢測時間約為常規免疫分析的1/4，是對現有小分子有機物免疫分析技術的發展和創新，迄今尚未見同類報道，在環境和食品中農藥、藥物、環境內分泌干擾物等小分子有機物快速檢測方面具有很高的開發應用前景。

附圖說明

圖1為不同濃度氯氰菊酯與量子點標記抗氯氰菊酯抗體熒光強度變化的關系曲線。

圖2為不同濃度氯霉素與量子點標記抗氯霉素抗體熒光強度變化的關系曲線。

圖3為不同濃度雙酚A與量子點標記抗雙酚A抗體熒光強度變化的關系曲線。

具體實施方式

一、量子點標記抗氯氰菊酯抗體非競爭均相免疫分析技術實施例

采用水溶性碳二亞胺（EDC）法（Greg?T.?Hermanson,?Bioconjugate?Techniques,?2ed?2008,?p495-496），將表面修飾有活性羧基的核殼結構(CdSe/ZnS)?熒光發射波長為625nmd的高效水溶性量子點與對氯氰菊酯具特異性親和力的抗體共價偶聯，制備量子點標記抗氯氰菊酯抗體，經透過分子量為5000的超濾離心管超濾純化后用含0.5g/L疊氮化鈉和1M/L甜菜堿、pH8.3的硼酸鹽緩沖液溶解定容至1μmoL/L，4℃保存備用，臨用前用0.02mol/L、pH7.2?PBS稀釋400倍。