[發(fā)明專利]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米成熟種子胚的轉(zhuǎn)基因方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110399284.2
• 申請(qǐng)日: 2012-01-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102433356A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李有志;潘虹;樊憲偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 黃永校

1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米成熟種子胚的基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建植物基因表達(dá)的質(zhì)粒載體；

(2)構(gòu)建含有步驟(1)中植物基因表達(dá)的質(zhì)粒載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；

(3)玉米成熟種子的裸露的胚的制備和創(chuàng)傷；

(4)步驟(2)中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的裸露并且經(jīng)創(chuàng)傷的玉米成熟種子胚的基因轉(zhuǎn)化；

(5)再生苗的除草劑抗性復(fù)篩；

(6)除草劑篩選處理后存活的苗移栽；

(7)玉米轉(zhuǎn)基因植株的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定。

2.權(quán)利要求1的玉米成熟種子的裸露的胚的制備和胚的創(chuàng)傷的應(yīng)用，其特征在于，具體步驟為：將成熟的玉米種子在無(wú)菌雙蒸水中浸泡過(guò)夜16～20h，將浸泡過(guò)夜的玉米種子在無(wú)菌操作臺(tái)上用刀片輕輕劃開(kāi)玉米種皮，再用滅菌縫衣針剝?nèi)ヅ呷椋羧∨撸瑢⑴咴儆?.1％的氯化汞滅菌處理8min，雙蒸水清洗四遍，最后用滅菌的縫衣針輕輕扎刺胚，對(duì)胚進(jìn)行創(chuàng)傷。

3.權(quán)利要求1的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的裸露并且經(jīng)創(chuàng)傷的米成熟種子胚的基因轉(zhuǎn)化，其特征在于，具體步驟為：將200粒裸露并且創(chuàng)傷的玉米成熟種子的胚轉(zhuǎn)入含100μM的乙酰丁香酮的OD₆₀₀為0.5的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液中，再加20ml的MS液體培養(yǎng)基和6μl的50mg/ml的乙酰丁香酮；在28℃，100rpm的搖床上培養(yǎng)18-20h；接著將創(chuàng)傷的玉米成熟種子的胚轉(zhuǎn)移到含MS、30g/L蔗糖、100μM乙酰丁香酮、7g/L瓊脂、pH6.0的共培養(yǎng)基上，在28℃黑暗共培養(yǎng)3天，

共培養(yǎng)后，先用雙蒸水將胚沖洗一次，再用含抗生素Cef的雙蒸水洗一次，接著再用雙蒸水洗一次，最后將其轉(zhuǎn)至含MS、0.1mg/L的IAA、250mg/L的抗生素Cef、20ppm的Basta、30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，pH6.0的抑菌及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周，然后先打開(kāi)瓶蓋，讓抗性苗28℃下，16h光照培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)至經(jīng)滅菌的土，在28℃，16h光照培養(yǎng)獲得除草劑Basta抗性玉米苗，所有涉及的實(shí)施過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。