[發明專利]Tat與人野生型P53融合蛋白在畢赤酵母中的表達

無效

• 申請號: 201110399224.0
• 申請日: 2011-12-06
• 公開（公告）號: CN103145845A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 顏煒群
• 申請（專利權）人: 吉林圣元科技有限責任公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12R1/84
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技術領域：

本發明涉及一種融合蛋白質的制備，特別是涉及蛋白轉導結構域(Tat)與人野生型P53融合蛋白(Tat-p53)的制備，以及純化Tat-p53融合蛋白的方法。

背景技術：

人類P53基因位于17p13.1染色體，全長16～20kb，由11個外顯子和10個內含子組成，是研究得最廣泛，最深入的抑癌基因，也是迄今發現的與腫瘤相關性最高的基因。P53基因編碼產物即為P53蛋白，是一種核酸蛋白，由393個氨基酸組成，分子量為43.7KDa。由于富含大量脯氨酸，在SDS-PAGE中顯示的分子量為53KDa，起初命名為P53，沿襲至今。P53分為野生型和突變型，野生型P53(wild-type?P53，wtP53)是細胞中最重要的腫瘤抑制劑，在細胞生長過程中，以“分子警察”的身份監控細胞內DNA的狀態，阻止受損DNA繼續復制，抑制細胞惡性增殖，通過誘導生長停滯或細胞凋亡來抑制腫瘤細胞生長，維持細胞正常生長，保證遺傳物質的穩定性。突變型P53是一種異常蛋白，能與人組織的各種病毒蛋白、熱休克蛋白等結合成穩定的復合物，或通過突變、重排、丟失等形式失活，DNA損傷不能被修復，細胞遺傳物質不穩定，導致細胞惡性增殖。P53基因是體內最重要的抑癌因子之一，人類惡性腫瘤中有一半以上存在P53基因的突變和缺失，它的結構改變和功能異常可能是這些腫瘤發生發展的重要環節之一。P53蛋白是一種磷酸化蛋白，半衰期短，只有20～30min，在正常細胞的細胞核中幾乎檢測不到。

在細胞生長過程中，wtP53蛋白是最重要的腫瘤抑制劑。因此，P53蛋白在腫瘤發生中作用機制的闡明，將為臨床腫瘤的預防、診斷和治療提供可靠的理論依據。通過導入wtP53來重建細胞內變異的P53已成為腫瘤治療的新策略。大量的實驗證實，野生型P53的導入對多類腫瘤產生明顯的抑制作用。但是由于wtP53屬于非分泌型蛋白，細胞膜上不存在P53受體或配體，P53很難穿透細胞膜進入細胞內發揮作用，進而達不到治療目的。國內外大部分的研究主要集中在通過載體將P53基因導入到細胞內，缺點是導入的載體存在不安全性因素。因此如何能使P53基因編碼產物P53蛋白進入細胞內發揮作用，避免導入載體的不安全性并且不影響P53蛋白的活性是應用wtP53治療腫瘤需要解決的問題。

近年來發現一種蛋白轉導結構域(Tat)，Tat蛋白是人類免疫缺陷病毒I型(HIV-I)的反式激活因子，它是一種正調控蛋白質，可以很大程度地提高HIV-I基因組的復制和轉錄水平，還能調節基因以及細胞的行為。作為新發現的一種蛋白轉導結構域，Tat蛋白能高效地介導與其共價連接的DNA、多肽、蛋白質等分子進入幾乎所有的組織和細胞，甚至可以通過血腦屏障，轉導效率高且對細胞幾乎沒有損傷，并且能保持蛋白的生物活性。Tat融合蛋白系統被認為是一種很有前途的高效運載工具，在基礎醫學研究和臨床治療方面都有著非常廣闊的應用前景。Tat蛋白可以引導多種多肽和蛋白質進入幾乎所有的靶細胞，這即是Tat蛋白的轉導作用，又稱為內化作用。Tat蛋白的轉導作用主要依賴于多肽或蛋白質的濃度，而不同于一般的通道、受體、內吞作用的的入胞方式。由于具有這一功能，Tat可被用來作為介導外源蛋白通過細胞膜的運載工具，因此日益受到人們的重視。Tat介導的蛋白轉導過程不依賴于轉運蛋白和受體，也不需要能量，即使在4℃下仍然可以順利進行。目前，推測這一過程和蛋白轉導域中堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的存在有關，這些氨基酸帶有很強的正電荷，可能通過直接與帶負電荷的細胞膜脂類相互作用而介導穿膜過程。這也使得其可以導入幾乎所有的細胞，甚至還可以通過血腦屏障。近來，應用這一技術已成功將分子量約15～120KD的數十種融合蛋白導入細胞內。操作中只需將與Tat-PTD融合的分子直接加入到組織培養介質中，15min內細胞內可達到最大濃度，且每個細胞內的蛋白濃度近乎相同。由此，應用Tat轉導外源蛋白既可以通過控制作用時間精確控制細胞內的蛋白濃度，通常20～200μmol/L的蛋白終濃度即可產生生物學表型。因此，與將蛋白引入細胞的傳統方法如微注射、穿孔蛋白及脂質體法等相比，Tat-PTD介導的蛋白轉導有著顯著的優越性。目前，對Tat蛋白能夠有效的介導基因、多肽、蛋白質以及一些其它的物質進入細胞的機制還不是很清楚。相關研究推測，它以低親和力與細胞上的受體相結合，通過破壞細胞質膜，以非內吞途徑轉導外源物質進入細胞內部。

本發明獲得的Tat-p53融合蛋白可通過Tat介導野生型p53蛋白進入細胞發揮作用，既不影響p53蛋白的活性，又可避免通過載體導入p53到細胞內引起的不安全因素，為腫瘤的治療開辟一個全新的設計思路與途徑。