[發(fā)明專利]電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110398232.3
• 申請日: 2011-12-05
• 公開（公告）號: CN103602599A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾衛(wèi)軍;孫藝鐸;祝長青;曹興芹;李學(xué)斌;王勇;遲慶杰;劉鳳衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆師范大學(xué);烏魯木齊高鑫博淵生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 烏魯木齊合縱專利商標(biāo)事務(wù)所 65105
• 代理人: 湯潔

1.一種電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行：

第一步，阿魏菇原生質(zhì)體制備及再生體系的建立：對選取的阿魏菇進(jìn)行接種，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)菇種；采用酶解法制備原生質(zhì)體，獲得較純的原生質(zhì)體后，鏡檢，用血球計數(shù)板計數(shù)；其最佳制備原生質(zhì)體的條件為：在0.6?mol/L?KCl穩(wěn)滲劑條件下，菌齡為8?天的阿魏菇菌絲體0.1?g在0.8?ml混合酶解液中制備原生質(zhì)體，該混合酶解液為含1.5%離析酶、0.5%纖維素酶、2%溶菌酶的水溶液，35?℃酶解3?h獲得原生質(zhì)體達(dá)5×10^6?個/ml，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，其最佳條件為：在0.8?mol/L?蔗糖穩(wěn)滲劑下，原生質(zhì)體再生時間為16天，其再生率可達(dá)0.6%；

第二步，外源基因的獲得，提取平菇總DNA：稱取平菇子實體放入已冷凍的研缽中，加入2%的PVP，倒入適量液氮，研磨材料，然后加入1mlCTAB混合，該CTAB為含DTT50μL?/ml的水溶液；倒入已加入100μL氯仿/辛醇的EP管中；晃動EP管，放入65℃水浴鍋中30min，接著室溫放置15min；EP管中加氯仿/辛醇到1.5mL，輕輕混勻，13000rpm離心7min；取上清液放入干凈EP管中，加入冰的無水乙醇；樣品放在冰上或-20℃，不要晃動，最后出現(xiàn)絮狀沉淀；13000rpm離心7min；棄去上清液，75%酒精/0.2M?NaAc?1mL洗滌沉淀2次，醇揮發(fā)后放入加無菌水和RNA酶，溶解，-20℃保存?zhèn)溆?；?.8%瓊脂糖電泳檢測DNA的純度；用分光光度計對DNA?進(jìn)行紫外掃描，測260nm、280nm的吸收值，計算出DNA的濃度，最后用無菌水把DNA濃度稀釋到1μg/μL；

第三步，電激法將外源基因?qū)氚⑽汗皆|(zhì)體：用1mol/L的山梨醇將純化的原生質(zhì)體稀釋至2×10⁵個/ml置于42℃浮浴5min，再向低溫處理過的2mL的電激杯加入300μL的原生質(zhì)體溶液和20μL平菇DNA，采用ECM630電激系統(tǒng)，在1600V條件下電激，取出電激杯冰浴靜止10分鐘至15分鐘，涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)，2周后，將出現(xiàn)的菌落進(jìn)行篩選實驗；

第四步，篩選優(yōu)良再生菌株：將第三步獲得的菌落、未電激的阿魏菇菌絲和平菇菌絲進(jìn)行生長臨界溫度篩選實驗；未電激的阿魏菇菌絲在32℃時菌絲停止生長甚至死亡，平菇在32℃時菌絲能正常生長，并且第三中的菌落同樣能夠生長，篩選出能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株；將能吸收平菇DNA片段的阿魏菇菌株繼續(xù)培養(yǎng)，測定生長速度，將生長速度明顯高于受體菌株的再進(jìn)行復(fù)篩；培養(yǎng)6天至7天，分別對單菌落進(jìn)行鏡檢，有鎖狀聯(lián)合特征的菌株視為一個轉(zhuǎn)化子；

第五步，轉(zhuǎn)化子的鑒定：1）酯酶同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法；2）纖維素酶活力測定采用3,5-二硝基水楊酸法；3）RAPD分析；最終，確定含有外源平菇DNA插入的轉(zhuǎn)化子，得到高溫型阿魏菇菌株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電激轉(zhuǎn)化法選育高溫型阿魏菇的方法,其特征在于將高溫型阿魏菇菌株在白天溫度為25℃、夜間溫度為17℃的現(xiàn)有公知的阿魏菇生長環(huán)境中進(jìn)行出菇試驗，90天能正常出菇。