[發(fā)明專利]一種鑒定金線魚的分子生物學方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110397448.8
• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN103131768A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 于曉軍;袁萬安;呂俊耀
• 申請（專利權）人: 汕頭大學醫(yī)學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一種鑒定常見珍稀鱸形目魚類的方法，特別涉及一種鑒定金線魚的分子生物學方法。

背景技術

保護生物多樣性，就是保護人類自己。由于水體生態(tài)環(huán)境的特殊性和大多數(shù)水產(chǎn)動物一直是人們捕捉的對象，魚類生物多樣性比陸生動物多樣性顯得更為脆弱，承受的壓力更大。保護好魚類種質資源，就是保護人類生存所必須的水產(chǎn)動物蛋白的生產(chǎn)源泉。魚類資源是一種可更新的資源，只要利用得當，就可取之不盡，經(jīng)久不衰，但如果酷捕濫捕，也可發(fā)生資源枯竭或個體變小、質量降低。捕撈并不是一個消極因素，只要捕撈合理，它可使魚類種群產(chǎn)生最大的生產(chǎn)量，人們可獲得最大持續(xù)量。全世界約有10億人以魚類為主要的蛋白質來源，但同農(nóng)作物及畜禽類不同的是，目前，人類所消費的魚類數(shù)量的80％以上依然來自天然捕撈產(chǎn)品。在全世界水產(chǎn)動物，如魚類中，只有少數(shù)種類已用于養(yǎng)殖，極大多數(shù)種類的養(yǎng)殖潛力尚待評估。據(jù)初步統(tǒng)計，僅中國，由于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展以及生活水平提高后對水產(chǎn)品需求的劇增，水域生態(tài)系統(tǒng)處于持續(xù)增長的壓力之下，處于瀕危狀態(tài)和受到嚴重威脅的魚類有97種。

由于魚類分布范圍廣泛，地理差異，生態(tài)環(huán)境的不同，使得各個地區(qū)的種類不同。由于人們的生活水平的提高，對魚產(chǎn)品的需求猛增，于是產(chǎn)生了對魚類的過渡捕撈，亂捕亂撈時有發(fā)生，再加上人們?yōu)榱藵M足各種需要而對魚類生態(tài)環(huán)境造成的破壞，使許多魚種瀕臨滅絕。雖然我們采取了一些措施，例如每年設立禁魚期，發(fā)布魚類保護白皮書，但由于沒有強有力的執(zhí)法隊伍，主要是缺乏快速、準確、經(jīng)濟、易于操作的魚類鑒別方法，所以遠遠達不到預期目的。

目前，常用的魚類鑒別方法主要是沿用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒別法，根據(jù)魚體各部位的形態(tài)特征，步驟繁多、操作繁瑣、工作量大、專業(yè)性強。其致命的弱點是要求魚體結構完整，各個部位特征發(fā)育完全，肉眼可以觀察鑒別。這在幼小魚體、魚體破碎或腐敗等情況下，難以進行鑒定，易于出錯。近年來國內外許多實驗室開始采用線粒體DNA分型、限制性長度多態(tài)性、同工酶電泳、隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)技術進行魚類鑒別，但這些方便普遍同樣具有繁瑣費時、費力、費錢，不利于操作，可重復性差，誤差大等弊端。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種耗費時間少、易于實驗室操作、方便直觀的鑒定常見珍稀鱸形目類中金線魚的分子生物學方法。

該方法包括兩大步驟：(1)確定金線魚的特異引物；(2)金線魚種類的鑒定。

步驟(1)又包括下面幾個步驟：

1.1設計并篩選出一對鱸形目魚類的核糖體5.8SrRNA和28SrRNA基因間的轉錄間隔子DNA片段的特異引物對作為鱸形目魚類通用引物對，該引物對為：正向引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′，反向引物5′-gtcttctttccccgctgatt-3′；

1.2用步驟1.1得到的通用引物對，對鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；

1.3將步驟1.2得到的常見珍稀鱸形目魚類的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序，根據(jù)測序結果選出每種常見珍稀鱸形目魚類與其它常見珍稀鱸形目魚類有差異的DNA片段；

1.4從步驟1.3中所選出DNA片段區(qū)域內，為金線魚設計并篩選出一條特異引物，該特異引物為：5′-atccggagagttcccaagtg-3′；

1.5用步驟1.1所得到的魚類通用引物對中的一條引物與步驟1.4得到的金線魚的特異引物配對，構成金線魚的特異引物對；

1.6用步驟1.5所得到的金線魚的特異引物對對鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進行PCR擴增；

1.7將步驟1.6所得到的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，從金線魚的DNA模板樣本中擴增得到的產(chǎn)物電泳后能得到顯著的條帶，而對其它常見珍稀鱸形目魚類的DNA模板樣本擴增產(chǎn)物電泳后則沒有明顯的條帶產(chǎn)生，從而得到金線魚的鑒定標準電泳條帶。

步驟(2)又包括下面幾個步驟：

2.1將步驟1.1中所得的通用引物對和步驟1.4中得到的金線魚的特異引物相混合，構成混合引物；

2.2采用步驟2.1所得到的混合引物，對需要鑒別的魚類DNA樣本進行PCR擴增；

2.3將步驟2.2所得到的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，如需要鑒別的魚類為金線魚，則電泳結果會得到兩條條帶，一條是通用引物擴增產(chǎn)物，一條是金線魚特異引物擴增產(chǎn)物；而其它鱸形目魚類樣本只有一條由通用引物對擴增產(chǎn)物的帶，非鱸形目魚類樣本則沒有電泳條帶。