[發明專利]阿特拉津單鏈抗體篩選方法及其用途

無效

• 申請號: 201110397033.0
• 申請日: 2011-12-05
• 公開（公告）號: CN103130897A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 寧保安;高志賢;彭媛;張亦紅;白家磊;柳明;范獻軍;孫思明
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N15/13;C12N15/63;C40B50/06
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1.一種抗阿特拉津單鏈抗體，其特征在于可以特異識別小分子農藥阿特拉津。

2.權利要求1抗阿特拉津單鏈抗體制備方法，由如下步驟組成：

(1)噬菌體展示鼠源免疫初級庫的構建

取AT-BSA免疫的Balb/c小鼠(血清效價1∶100000)的脾細胞中提取總RNA，反轉錄合成cDNA第一鏈后，擴增VH、VL基因片段，大小分別為350bp，350bp左右；合成(G4S)3連接序列。利用SOE-PCR構建單鏈抗體文庫，大小為750bp，經EcoR?I和HindIII雙酶切后，通過T4連接酶與T7Select?10-3載體進行連接。經體外包裝后感染宿主BLT5403或BLT5615，宿主裂解增殖后后即完成噬菌體展示單鏈抗體文庫初級庫的構建。

(2)抗阿特拉津單鏈抗體庫的篩選

用阿特拉津直接偶聯經處理后氨基化的酶標板作為抗原固相篩選或者阿特拉津偶聯氨基化磁珠進行篩選，淘篩過程如下：

①加入滴度為2×10¹⁰的噬菌體初級庫500uL，37孵育2h，

②500uL?PBST(含0.1％Tween?20的PBS)洗滌3次，

③加入200uL?1％SDS洗脫噬菌體。100uL噬菌體用于測定洗脫滴度，另100uL噬菌體擴增后進入下一輪篩選。

如此進行“孵育-洗脫-擴增”3個循環。以未展示有抗體的空白噬菌體作陰性對照，以洗脫的噬菌體作為一抗，兔抗T7噬菌體10A蛋白做作為二抗，噬菌體ELISA測定噬菌體的結合活性，間接競爭ELISA測定噬菌體競爭活性，具有競爭結合活性的噬菌體克隆進入下一輪篩選。

(3)抗阿特拉津單鏈抗體的功能表達

將四輪篩選后單鏈抗體文庫進行序列鑒定，PCR從噬菌體基因組中擴增抗體基因，Eco?R?I和Xho?I雙酶切后連接pTIG-Trx表達載體，轉化BL21(DE3)后IPTG誘導表達，經SDS-PAGE和Western?Blot鑒定，在30KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達產物存在于破碎菌體后的沉淀中。

(4)抗阿特拉津單鏈抗體的純化與鑒定

利用6mol/L鹽酸胍變性破碎后的菌體沉淀，用HisTrap?HP柱進行復性并純化。直接ELISA測定scFv的結合活性，間接競爭ELISA測定競爭結合活性與特異性

3.權利要求2中所述小鼠可以是其他品系免疫AT-BSA后的小鼠，優選Balb/c小鼠。

4.權利要求2中所述單鏈抗體文庫兩端的酶切位點可以是常見分子生物學內切酶(如BamH?I、SfiI等)雙酶切或單酶切，本發明優選EcoR?I和HindIII雙酶切.。

5.權利要求2中所述增殖方法包括固體平板法和液體增殖法，優選固體平板法。

6.權利要求2中所述篩選方法可以采用直接包被法進行固相篩選，還可以采用AT-磁珠進行液相篩選，優選在不同篩選輪次中采用不同方法交叉篩選。

7.權利要求2中所述洗脫條件可以選擇pH梯度洗脫，競爭洗脫和蛋白酶酶解洗脫，本發明優選1％SDS洗脫。。

8.權利要求2中所述抗體的表達可以采用原核表達載體如pBV220，pET系列載體，并根據載體不同選擇不同表達宿主，優選pTIG-TRX載體。

9.權利要求2中所述標簽蛋白可以為麥芽糖結合蛋白、6×組氨酸標簽等，優選6×組氨酸標簽。

10.權利要求7中所述直接包被法根據改造后阿特拉津的結構不同可以采用不同的偶聯方法如DCC法，戊二醛法等，本發明優選DCC法。