[發(fā)明專利]一種鑒定短尾大眼鯛的分子生物學方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110397032.6
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN103131764A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 袁萬安;于曉軍;游翠紅
• 申請（專利權(quán)）人: 汕頭大學醫(yī)學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鑒定短尾大眼鯛的分子生物學方法，其特征在于它包括兩大步驟：(1)確定短尾大眼鯛的特異引物；(2)短尾大眼鯛種類的鑒定。

步驟(1)又包括下面幾個步驟：

1.1設計并篩選出一對鱸形目魚類的核糖體5.8SrRNA和28SrRNA基因間的轉(zhuǎn)錄間隔子DNA片段的特異引物對作為鱸形目魚類通用引物對，該引物對為：正向引物5′-gtcgatgaagaacgcagcta-3′，反向引物5′-gtcttctttccccgctgatt-3′；

1.2用步驟1.1得到的通用引物對，對鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；

1.3將步驟1.2得到的常見珍稀鱸形目魚類的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果選出每種常見珍稀鱸形目魚類與其它常見珍稀鱸形目魚類有差異的DNA片段；

1.4從步驟1.3中所選出DNA片段區(qū)域內(nèi)，為短尾大眼鯛設計并篩選出一條特異引物，該特異引物為：5′-agctaaggcttacgaccctg-3′；

1.5用步驟1.1所得到的魚類通用引物對中的一條引物與步驟1.4得到的短尾大眼鯛的特異引物配對，構(gòu)成短尾大眼鯛的特異引物對；

1.6用步驟1.5所得到的短尾大眼鯛的特異引物對對鱸形目中常見珍稀魚類的DNA模板樣本進行PCR擴增；

1.7將步驟1.6所得到的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，從短尾大眼鯛的DNA模板樣本中擴增得到的產(chǎn)物電泳后能得到顯著的條帶，而對其它常見珍稀鱸形目魚類的DNA模板樣本擴增產(chǎn)物電泳后則沒有明顯的條帶產(chǎn)生，從而得到短尾大眼鯛的鑒定標準電泳條帶。

步驟(2)又包括下面幾個步驟：

2.1將步驟1.1中所得的通用引物對和步驟1.4中得到的短尾大眼鯛的特異引物相混合，構(gòu)成混合引物；

2.2采用步驟2.1所得到的混合引物，對需要鑒別的魚類DNA樣本進行PCR擴增；

2.3將步驟2.2所得到的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，如需要鑒別的魚類為短尾大眼鯛，則電泳結(jié)果會得到兩條條帶，一條是通用引物擴增產(chǎn)物，一條是短尾大眼鯛特異引物擴增產(chǎn)物；而其它鱸形目魚類樣本只有一條由通用引物對擴增產(chǎn)物的帶，非鱸形目魚類樣本則沒有電泳條帶。

2.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定短尾大眼鯛的分子生物學方法，其特征在于在所述步驟1.2中，對鱸形目中常見的珍稀魚類的DNA模板分別進行PCR擴增時，鱸形目中常見的珍稀魚類是指：短尾大眼鯛、真鯛、平鯛、黑鯛、黃鰭鯛、銀鯧、卵形鯧鲹、日本金線魚、金線魚、花鱸、鱖魚、大黃魚、赤點石斑魚、細鱗三梭魚、尖吻鱸、發(fā)光鯛、長尾大眼鯛、軍曹魚、藍圓鲹、烏鯧、短體銀鱸等。

3.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定短尾大眼鯛的分子生物學方法，其特征在于步驟1.2、1.6和2.2中，提取魚類樣本的DNA時，可以按以下常規(guī)方法進行提?。篴、取魚類新鮮組織，如魚的肌肉、魚鱗、魚鰭、魚卵、魚血、魚類粘液等，置于1.5ml的離心管消化過夜，用酚-氯法提取DNA；b、魚類烘干或曬干制品，魚類罐頭制品，可以直接取樣，同新鮮組織一樣提取DNA；c、對于用95％酒精保存的魚類組織樣本，需用雙蒸水浸泡過夜，再用酚-氯法提取DNA。

4.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定短尾大眼鯛的分子生物學方法，其特征在于在步驟1.2、1.6和2.2中，對魚類DNA樣本進行PCR擴增時，PCR反應體系中的各種成份及其濃度如下：DNA樣本(3μl)，DDH₂0(22.0μl)，dNTP(200μM)，10×緩沖液(3.6μl)，市售Taq酶(3U)，MgCl₂(2.25mM)，其中各類引物的添加量均為40nM。整個復合擴增循環(huán)參數(shù)如下：94℃預變性6分鐘，94℃變性30秒，64℃復性60秒，72℃延伸60秒，循環(huán)次數(shù)34次；72℃延伸10分鐘。

5.依據(jù)權(quán)利要求1中所述的一種鑒定短尾大眼鯛的分子生物學方法，其特征在于在步驟1.7和2.3中，進行瓊脂糖凝膠時，將樣本擴增產(chǎn)物3μl、分子量馬克2μl以及凝膠載樣緩沖液2μl加入到10ml的2％的瓊脂糖凝膠溶液(每100ml瓊脂糖凝膠溶液中加入10u的11‰的溴乙淀)處理30-40分鐘。