[發(fā)明專利]細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110396011.2
• 申請(qǐng)日: 2011-12-02
• 公開（公告）號(hào): CN102618494A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林詠凱;尤偉勛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 林詠凱;尤偉勛
• 主分類號(hào): C12N5/074
• 分類號(hào): C12N5/074
• 代理公司: 北京銀龍知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11243
• 代理人: 金鮮英;馮云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明關(guān)于一種新式細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑。

背景技術(shù)

干細(xì)胞于近幾年來成為組織工程的首要研究之一，其可分化為多種組織細(xì)胞以應(yīng)用于再生醫(yī)療，如：骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞及胰島細(xì)胞等，但臨床及組織應(yīng)用最大的瓶頸是無法在體外快速培養(yǎng)至治療所需的數(shù)量，以致難以普遍實(shí)際應(yīng)用于醫(yī)療上。

目前許多研究胎牛血清(fetal?bovine?serum，F(xiàn)BS)普遍被應(yīng)用作為細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑。胎牛血清是一種源自未出生胎牛血液通過離心程序去除紅血球后所得的血清，一般添加5～20％的胎牛血清于培養(yǎng)基中以促進(jìn)細(xì)胞的增生。使用胎牛血清作為培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，一直是受到爭議的問題，其生產(chǎn)與使用始終伴隨著倫理及科學(xué)的爭議。通常胎牛血清的收集部分是一導(dǎo)管插入臍帶收集血液，另一方法則是利用12到16針規(guī)(gauge)的針頭直接插入胎牛的心臟并抽取血液，兩種方式皆可能造成胎牛的痛苦。目前全球每年胎牛血清的生產(chǎn)量約為50萬升，而每頭胎牛僅能取得約0.5升的血清，推算可得知每年約有百萬頭胎牛因此而犧牲，而此胎牛血清的制造一直被動(dòng)物保護(hù)人士所詬病。而在科學(xué)上，血清含豐富的蛋白質(zhì)、生長因子、激素、營養(yǎng)素與代謝物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)與抑制物，其組成復(fù)雜且具有存在污染物的可能性，常對(duì)研究質(zhì)量造成影響。

在臺(tái)灣，一頭達(dá)上市體重的肉豬約可取得2.5升的血液，則臺(tái)灣一年應(yīng)可收集約2200萬升的豬血液(農(nóng)委會(huì)網(wǎng)站http://www.coa.gov.tw/show_index.php，2009畜牧統(tǒng)計(jì))。目前臺(tái)灣境內(nèi)收集豬血液后的利用主要加工成為食品或經(jīng)噴霧干燥后制成飼料用血粉，同時(shí)豬的生理組成及構(gòu)造與人類相似，可將其血液作為利用。而血液制劑(blood?product，BP)則是一種經(jīng)處理的血小板濃縮血漿，其較全血高出約8倍的血小板濃度，其中每個(gè)血小板約含有50～80個(gè)α顆粒(α-granules)，血小板在正常生理凝血反應(yīng)下，會(huì)聚集于受傷組織并刺激α顆粒釋放生長因子使傷口愈合，其α顆粒經(jīng)活化后可釋放多種生長因子，如：胰島素樣生長因子(insulin-like?growth?factor，IGF)、角質(zhì)化細(xì)胞生長因子(keratinocyte?growth?factor，KGF)、血小板來源生長因子(platelet-derived?growth，PDGF)及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming?growth?factor，TGF-β)等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明自豬血液開發(fā)一種合適于細(xì)胞培養(yǎng)用的新式營養(yǎng)添加劑，自豬血液以不同離心方式濃縮制成豬血液制劑(porcine?blood?product，P-BP)，加入不同活化劑組合配方活化血小板以釋放生長因子。經(jīng)定量分析后以Design-Expert軟件設(shè)計(jì)最佳的活化劑配方，并檢測重金屬及纖維連接素含量。配制成培養(yǎng)基與胎牛血清及市售無血清培養(yǎng)基，以比較對(duì)人類干細(xì)胞粘附率、增生率及存活率的影響。本發(fā)明中設(shè)計(jì)Co(+)T(+)Ca(-)、Co(+)T(-)Ca(-)及Co(-)T(+)Ca(-)等三組為最佳活化配方。含量分析結(jié)果顯示P-BP不含有害的重金屬，而纖維連接素含量較市售血清少，在細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果同時(shí)顯示細(xì)胞的粘附較緩慢。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示三種P-BP可促進(jìn)細(xì)胞增生率及存活率。由此可知，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑可更有效地促進(jìn)細(xì)胞的增生速度，并達(dá)市售培養(yǎng)基2倍以上的效果。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑可使細(xì)胞于較短時(shí)間內(nèi)大量增生，可快速培養(yǎng)細(xì)胞將其應(yīng)用于組織工程，或應(yīng)用于再生醫(yī)療上使用。相較于市售培養(yǎng)基，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑可顯著地降低細(xì)胞的破裂及形態(tài)上傷害，并提供細(xì)胞最適生長環(huán)境。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)添加劑還可與生物材料(biomaterial)結(jié)合，放置于生物體內(nèi)達(dá)傷口快速修復(fù)及愈合的效果，以幫助再生醫(yī)療領(lǐng)域的發(fā)展。

本文中所使用的術(shù)語意義除非另有特別界定，否則均與熟習(xí)此所述技藝者的普遍認(rèn)知相同。本申請(qǐng)案中使用的術(shù)語其意義如下所列：

“血小板活化劑”意指任何可刺激血小板釋放生長因子的物質(zhì)，該生長因子通常可促進(jìn)細(xì)胞快速增生。生長因子包括但不限于IGF、KGF、PDGF或TGF-β。