[發明專利]H9亞型禽流感病毒Vero細胞適應株及其應用

有效

• 申請號: 201110393293.0
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102586194A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 丁國杰;張楊;孫德君;吳金;姜力;張明艷
• 申請（專利權）人: 哈藥集團生物疫苗有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種能夠在Vero細胞中穩定增殖的細胞株及其應用，特別涉及一種H9亞型禽流感病毒Vero細胞適應株及其應用。屬于疫苗制備領域。?

背景技術

禽流行性感冒(簡稱禽流感，AI)是由A型流感病毒引起的禽類的感染和/或疾病綜合癥。引起AI的病原稱為禽流感病毒。?

根據世界動物衛生組織(OIE)的疾病分類標準，高致病性禽流感屬A類疾病，我國也將其列為一類傳染病，其傳播速度快、發病率和死亡率高；而中等到低等毒力的AIV可引起亞臨床癥狀，出現產蛋下降、呼吸系統或全身性感染等多種程度不同的各種癥狀。雞群感染該病毒，嚴重影響雞的生產性能。肉仔雞增重減慢，死亡數量增加，易繼發患其它細菌性疾病。H9N2亞型AIV是一種低等毒力的病毒，可引起臨床或亞臨床癥狀。目前，在全世界從各種家禽和野生禽中分離到上千株H9N2亞型AIV，90年代以來，在世界許多國家發生；自1998年，國內許多雞群發生H9N2亞型禽流感的報道，H9N2亞型AIV在我國廣泛存在，并且多呈低致病性感染，然而由于其分布廣泛并且有逐漸蔓延之勢，因此給養禽業造成的威脅是巨大的。?

預防該病最行之有效的辦法就是疫苗的接種，目前，市售的禽流感疫苗絕大多數為雞胚組織苗，相對于細胞苗而言，其具有成本高、產品質量批間差大、且容易生產雞源性潛在疾病的感染等缺點。近幾年，隨著禽流感的頻繁暴發以及跨種屬傳播，需要一種可在流感大流行時能夠替代雞胚快速、大量生產流感病毒的細胞培養系統。?

發明內容

針對現有技術中的問題，本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠在Vero細胞中穩定增殖的H9亞型禽流感病毒Vero細胞適應株。?

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術手段實現的：?

2011年初，本發明人從黑龍江省雙城市郊某養殖場分離得到一株禽流感病毒(H9亞型)病毒株，其具有經胰酶處理后能在細胞上增殖的特性，基于此，本研究針對組織苗的不足，HY株的特性，將其馴化為一株能夠在Vero細胞上良好增殖的VERO細胞適應株，并將其命名為H9亞型禽流感病毒VERO細胞適應株AIV?HY株，其具有經胰酶處理后能在細胞上增殖的特性，可用于在Vero傳代細胞中增殖進而制備禽流感病毒滅活疫苗。?

所述的H9亞型禽流感病毒VERO細胞適應株AIV?HY株，分類命名為禽流感病毒(H9亞型)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為：CGMCC?5409，保藏日期為2011年10月28日。?

本發明的H9亞型禽流感病毒VERO細胞適應株AIV?HY株是通過以下方法制備得到的：?

1病毒的分離?

病料來自黑龍江省雙城市郊某養殖場，采集瀕死雞氣管拭子和泄殖腔拭子，用2000單位青、鏈霉素溶液中處理后，接種雞胚，收集48h～78h雞胚尿囊液。對收獲的雞胚液進行血凝試驗，HA血凝價為9log2。?

2病毒分離株血凝抑制(HI)試驗?

分別用H5、H7和H9亞型AI標準陽性血清及ND、EDS-76病毒標準陽性血清與HA為陽性的雞胚尿囊液進行HI試驗。結果表明，與H5、H7、ND和EDS-76病毒標準陽性血清反應為陰性，與H9亞型AI標準陽性血清反應為陽性。?

3在Vero細胞的傳代與收獲?

3.1將收獲的組織毒，用滅菌生理鹽水稀釋后，接種80％長成單層后的Vero細胞，37℃培養3天，放入-20℃中凍融3次，收獲病毒液。?

3.2重復上述試驗10次，直至病毒在Vero細胞增值良好。?

本發明的H9亞型禽流感病毒VERO細胞適應株AIV?HY株可用于制備H9亞型禽流感病毒病毒液，其病毒增殖速度和產量上都優于目前雞胚培養的禽流感病毒，以及未馴化的H9亞型禽流感病毒病毒株。?

將本發明的H9亞型禽流感病毒VERO細胞適應株AIV?HY株用于制備H9亞型禽流感滅活疫苗，具有廣泛的應用前景。?

本發明一種疫苗組合物，其特征在于含有本發明所述的H9亞型禽流感病毒Vero細胞適應株。所述的疫苗組合物，其特征在于還可進一步包含藥學上接受的載體或佐劑。?

通過比較實驗發現，利用本發明的VERO細胞適應株AIV?HY株生產疫苗新方法與利用雞胚生產的老方法的比較，具有以下優點：?

1、維持液中加入的胰蛋白酶是經過殼聚糖包被后，起到緩慢釋放的作用；?

2、細胞苗在增殖速度和產量上都優于目前雞胚培養的禽流感疫苗；?