[發明專利]谷氨酸棒桿菌及采用該菌發酵生產α-酮戊二酸的方法

有效

• 申請號: 201110392778.8
• 申請日: 2011-12-01
• 公開（公告）號: CN102391977A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 陳寧;謝希賢;徐慶陽;劉淑云;謝沛
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/50;C12R1/15
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一株α-酮戊二酸產生菌，特別是一種生產α-酮戊二酸的谷氨酸棒桿菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產α-酮戊二酸。

背景技術

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，又稱為α-膠酮酸，2-氧代戊二酸，α-羰基戊二酸，分子式：C₅H₆O₅，分子量146.1，外觀為白色或類白色結晶粉末，易溶于水，在細胞代謝中起著重要的作用，是三羧酸循環的重要中間產物之一，在生物體內參與氨基酸、蛋白質、維生素的合成以及能量代謝。α-酮戊二酸廣泛應用于食品、醫藥、有機合成、化妝品和飼料等工業中。在食品工業中，α-酮戊二酸可作為運動營養飲料的主要成分，另外作為一種營養強化劑能有效降低術后患者和病人的機體損耗主要。在醫藥工業中，α-酮戊二酸主要作為生化試劑和測肝功能的配套試劑。另外α-酮戊二酸還具有抗氰作用，與亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉配合使用可提高抗氰能力，具有抗驚厥作用。在飼料工業中，α-酮戊二酸可以提高動物抗應激能力，增強免疫功能，促進骨骼發育，提高繁殖率。隨著α-酮戊二酸應用范圍不斷擴大，市場需求也在不斷增長。

α-酮戊二酸生產方法主要有有機合成法和微生物發酵法。目前α-酮戊二酸的生產主要采用的是有機合成法，以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等為原料，經縮合、水解合成α-酮戊二酸。有機合成法雖然具有收率高、原料易得、反應步驟短、反應條件溫和、易于工業化放大的特點，但在多步復雜的合成反應過程中會產生大量副產物從而增加分離難度、降低生產率，同時也會產生諸如氰化物等劇毒品及重金屬污染。

微生物發酵法生產α-酮戊二酸的研究最早始于1946年，Lockwook和Stodola首先對利用細菌生物合成α-酮戊二酸進行了初步的研究。上世紀60年代，Tsugawa等首次發現了解脂亞洛酵母具有過量合成α-酮戊二酸的能力。發酵法生產α-酮戊二酸取得突破是在上世紀90年代末，Finogenva等選育出一株可以利用乙醇為唯一碳源生產α-酮戊二酸的高產菌解脂亞洛酵母N1，同時研究了硫胺素濃度、氮源濃度、溶氧以及pH值等營養與環境條件對α-酮戊二酸產量的影響。通過在發酵后期補加氮源并使發酵液中氮源濃度維持在0.9～1.3g/L，溶氧維持在5％，發酵進行到144h時α-酮戊二酸產量達到49g/L，α-酮戊二酸對乙醇產率系數0.42，實現了α-酮戊二酸的過量積累。李寅等在研究光滑球擬酵母WSH-IP303丙酮酸發酵過程的代謝網絡分析時發現，在WSH-IP303搖瓶發酵中有少量的α-酮戊二酸的積累，且α-酮戊二酸的產量隨著CaCO₃、硫胺素、生物素濃度的增加及裝液量的減少而增加。陳堅等從煉油廠附近的土壤中篩選出硫胺素營養缺陷型的解脂亞洛酵母WSH-Z06，通過對發酵培養基中組成成分進行優化，發酵6d時α-酮戊二酸產量達到39.3g/L。綜上，目前發酵法生產α-酮戊二酸的研究主要集中在解脂亞洛酵母和光滑球擬酵母，從已報道的產量來看，個別菌株也具備了一定工業化生產潛力。但采用解脂亞洛酵母或光滑球擬酵母發酵生產α-酮戊二酸仍然存在如發酵周期過長(＞70h)，產量偏低，生產成本過高等問題。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術存在的上述不足，提供一種α-酮戊二酸產生菌和用該菌株發酵法生產α-酮戊二酸。該制備方法能顯著提高α-酮戊二酸產量、縮短生產周期、降低生產成本。

本發明的技術方案：

本發明提供的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?glutamicum)GKG-047，已于2011年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC?No.5481，該菌株具有酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰胺抗性和甲氨喋呤敏感的遺傳標記；谷氨酸棒桿菌突變株GKG-047在氮源充足的情況下積累L-谷氨酸，在氮源限量供應的情況下積累α-酮戊二酸。

本發明所述采用谷氨酸棒桿菌GKG-047經發酵生產α-酮戊二酸的方法，其步驟如下：

第1、種子培養：從新鮮活化斜面挑取一環谷氨酸棒桿菌GKG-047接入裝有20～30mL種子培養基的500mL三角瓶中，8層紗布封口，置于迴轉式搖床上，200～300r/min，32～36℃振蕩培養6～8h；