[發(fā)明專利]游離前列腺特異抗原與總前列腺特異抗原一體化酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110392250.0
• 申請日: 2011-12-02
• 公開（公告）號: CN103134929A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會(huì)強(qiáng);魏剛;李廼昶;王學(xué)謙;許連順
• 申請（專利權(quán)）人: 沃克(天津)生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/574
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標(biāo)代理有限公司 12103
• 代理人: 董光仁

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫法檢測血清前列腺特異抗原，具體是一種游離前列腺特異抗原與總前列腺特異抗原一體化酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及制備方法。?

背景技術(shù)

前列腺特異抗原(prostate?specific?antigen，PSA)作為一種重要的生物學(xué)標(biāo)志物用于，前列腺癌(prostate?cancer，PCa)患者的早期篩查、治療效果評估。但是，由于一些良性前列腺組織增生也表現(xiàn)為血清PSA升高，即血清總PSA水平變化并不能清晰辨別是前列腺的良性增生還是前列腺癌存在的可能。而采用血清游離PSA(f-PSA)與總PSA(t-PSA)比值(F/T，正常值＞0.16)篩查前列腺癌(PCa)，可提高篩查的準(zhǔn)確性。F/T值在診斷灰區(qū)(t-PSA?4.0～10.0ng/ml)可很好地區(qū)分前列腺癌與良性前列腺增生。因此，同時(shí)測定游離PSA和總PSA并計(jì)算其比值(f-PSA/t-PSA)具有更重要的臨床診斷價(jià)值，。?

前列腺特異抗原具有良好的免疫原性，能制備特異性抗體并通過免疫化學(xué)方法測定。游離PSA和總PSA抗原特異性不同，可通過不同單克隆抗體識(shí)別與檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA)具有操作簡便、對實(shí)驗(yàn)室條件要求不高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層醫(yī)院開展或高危人群批量測定。血清總PSA采用雙抗體夾心測定，篩選兩種針對總PSA不同抗原表位的單克隆抗體，分別包被微孔板和標(biāo)記辣根過氧化物酶。測定時(shí)如標(biāo)本中含有前列腺特異抗原，將被包被抗體捕獲并與酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成包被抗體-前列腺特異抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物。未結(jié)合的物質(zhì)通過洗滌去除，再加入顯色底物并顯色，通過測量光密度的變化來判斷標(biāo)本中前列腺特異抗原的濃度。血清游離PSA測定方法與總PSA相同，只是采用針對游離PSA的捕獲抗體和酶標(biāo)抗體。?

生物素(biotin，B)分子量為244.31，為雙環(huán)結(jié)構(gòu)，I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素(或鏈霉親和素)結(jié)合的部位；II為噻吩環(huán)，含一個(gè)戊酸側(cè)鏈，其末端羧基可與生物大分子連接，形成生物素標(biāo)記抗原、抗體、酶等。鏈霉親合素(streptavidin，SA)，分子量為65KD，由四條相同的肽鏈組成，一個(gè)鏈霉親合素分子能結(jié)合四個(gè)生物素分子。根據(jù)生物素與鏈霉親和素相結(jié)合這一特性所建立的體系稱為生物素-親和素系?統(tǒng)。如今生物素-親和素系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于標(biāo)記免疫分析技術(shù)，改善包被工藝或提高標(biāo)記信號強(qiáng)度。?

綜上所述，臨床醫(yī)生通常將血清總PSA水平用于前列腺癌高危人群篩查和評估療效，f-PSA/t-PSA比值優(yōu)于單獨(dú)測定總PSA(t-PSA)和游離PSA(f-PSA)，進(jìn)而提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。?

但是，目前臨床實(shí)驗(yàn)室不能直接獲得f-PSA/t-PSA的比值，而是分別使用f-PSA和t-PSA兩種診斷試劑盒分別測定血清中f-PSA和t-PSA水平，再計(jì)算f-PSA/t-PSA的比值。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中，需要分別使用f-PSA和t-PSA兩種診斷試劑盒分別測定血清中f-PSA和t-PSA水平，再計(jì)算f-PSA/t-PSA的比值的問題，而提供一種臨床實(shí)驗(yàn)室直接獲得f-PSA/t-PSA的比值的游離前列腺特異抗原與總前列腺特異抗原一體化酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及檢測方法。?

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。?

一種游離前列腺特異抗原與總前列腺特異抗原的一體化酶聯(lián)免疫檢測方法，其是將生物素標(biāo)記抗總PSA單克隆抗體和生物素標(biāo)記抗游離PSA單克隆抗體，分別加入到同一鏈霉親和素包被酶標(biāo)反應(yīng)板的2個(gè)孔中，加入待檢血清，37℃溫育30分鐘，棄掉反應(yīng)液體，加洗滌緩沖液，靜置后棄液、拍干；再加入等量酶標(biāo)記PSA抗體，37℃溫育30分鐘，加洗滌緩沖液，去除未結(jié)合酶標(biāo)記抗體、拍干；分別加入顯色底物，避光反應(yīng)15分鐘；各孔加入終止液，終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀讀取吸光度值，通過計(jì)算F孔A₄₅₀/T孔A₄₅₀獲得f-PSA/t-PSA比值。?

所述游離前列腺特異抗原與總前列腺特異抗原的一體化酶聯(lián)免疫檢測方法，其生物素標(biāo)記抗總PSA單克隆抗體和生物素標(biāo)記抗游離PSA單克隆抗體是篩選出的兩種單克隆抗體，分別識(shí)別游離前列腺特異抗原和總前列腺特異抗原，同時(shí)，將兩種抗體分別標(biāo)記生物素。?

所述游離前列腺特異抗原與總前列腺特異抗原的一體化酶聯(lián)免疫檢測方法，其酶標(biāo)記抗體是一種同時(shí)識(shí)別總PSA和游離PSA，并與二者發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的共用的多克隆抗體，將共用的多克隆抗體與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)。?