[發(fā)明專利]豬睪丸克隆細胞系及其生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110391978.1
• 申請日: 2011-11-30
• 公開（公告）號: CN102965332A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張許科;孫進忠
• 申請（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/02;A61K39/187;A61P31/14;C12R1/91
• 代理公司: 北京華夏正合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種動物細胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法及產(chǎn)品，特別是指一種使用豬睪丸克隆細胞系生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法及產(chǎn)品。

背景技術(shù)

豬瘟是由豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，不同年齡、性別和品種的豬均能感染，死亡率高達80-90％。豬瘟被世界世界動物衛(wèi)生組織劃分為A類疾病，我國將其劃分為一類疾病。中國學(xué)者培育成功的豬瘟兔化弱毒苗是目前世界上公認的安全和有效的疫苗，借助于C株疫苗密集接種和綜合防制措施，有關(guān)國家已經(jīng)有效地控制了豬瘟，甚至消滅了豬瘟。在我國，豬瘟流行出現(xiàn)典型豬瘟與非典型豬瘟共存、持續(xù)感染與隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等，因此，豬瘟新的流行形式給我國養(yǎng)豬業(yè)防治本病提出了新的挑戰(zhàn)。

疫苗接種仍是我國目前防治豬瘟的主要措施，我國目前生產(chǎn)豬瘟兔化弱毒苗用的細胞有牛睪丸細胞、豬腎細胞(IBRS-2或PK15細胞系)、豬睪丸細胞(ST細胞)。但在該疫苗生產(chǎn)實踐中證實用上述細胞生產(chǎn)的疫苗，其病毒滴度不高，生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定，特別是病毒滴度隨細胞傳代數(shù)的增加迅速降低，導(dǎo)致疫苗批次之間的差異很大。

此外，由于牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒同屬于黃病毒科瘟病毒屬，兩種病毒的同源性很高，因此污染了BVDV的牛睪丸細胞或犢牛血清都會造成疫苗污染，而我國牛群中病毒性腹瀉病毒(BVDV)的感染率很高，用這樣的動物細胞生產(chǎn)的豬瘟活疫苗免疫豬，往往造成免疫失敗，引起嚴重的后果。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種豬睪丸克隆細胞，及其生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法及產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的一種高感染豬瘟病毒的豬睪丸克隆細胞，命名為豬睪丸細胞系(swine?testicular?cell?lines)克隆株ST-B2，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC?NO：C2011101，保藏日期為2011年11月07日。

本發(fā)明中豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞，是指對豬瘟病毒感染高的豬睪丸克隆細胞，特別指可以生產(chǎn)高滴度的豬瘟病毒的豬睪丸克隆細胞，也即指可以生產(chǎn)高效價的豬瘟活疫苗的豬睪丸克隆細胞。

本發(fā)明還提供了一種如上所述的豬睪丸克隆細胞的制備方法，包括以下步驟：

1)將豬睪丸細胞進行有限稀釋進行細胞克隆和亞細胞克隆，獲得亞細胞克隆株；

2)選擇對豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞。

優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的使用豬睪丸克隆細胞的制備方法中，所述的步驟1)為使用未被病毒感染的豬睪丸細胞，經(jīng)胰蛋白酶消化為單細胞后進行梯度稀釋，分別在37℃?5％CO₂的條件下培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)至肉眼可見細胞克隆后，進行亞細胞培養(yǎng)，獲得亞克隆細胞株；

優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的使用豬睪丸克隆細胞的制備方法中，所述的步驟2)為將豬睪丸細胞亞克隆株接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，接種豬瘟病毒于37℃?5％CO₂的條件下培養(yǎng)2h，使用免疫過氧化酶單層細胞試驗法檢測感染病毒最多的細胞，選擇對豬瘟病毒感染率最高的豬睪丸細胞的亞克隆株即為豬瘟病毒的高感染性豬睪丸克隆細胞。

本發(fā)明還提供了一種如上所述的豬睪丸克隆細胞用于高滴度的豬瘟病毒液的制備方法，將上述的豬睪丸克隆細胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細胞維持液，37℃含5％CO₂溫箱中培養(yǎng)2-3d，待細胞長滿單層后，按照1∶3的比例傳代，同時收獲傳代細胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液。

優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法中，所述傳代次數(shù)為可以大于15代。

優(yōu)選地，本發(fā)明如上所述的高滴度的豬瘟病毒液的制備方法中，所述的病毒滴度為大于10^6.0TCID₅₀/ml。

本發(fā)明還提供了一種使用如上1所述的豬睪丸克隆細胞生產(chǎn)豬瘟活疫苗的方法，包括以下步驟：

1)生產(chǎn)用種子批病毒液的制備：將權(quán)利要求1所述的豬睪丸克隆細胞用胰酶消化后，同步接種含新鮮脾毒的細胞維持液，37℃含5％CO₂溫箱中培養(yǎng)2-3d，待細胞長滿單層后，按照1∶3的比例傳代2次，同時收獲第二代、第三代的傳代細胞的上清病毒液即可獲得高滴度的豬瘟病毒液；