[發(fā)明專利]一株蒼白桿菌及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110388563.9
• 申請日: 2011-11-30
• 公開（公告）號: CN102433275A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊金奎;張克勤;雷麗萍;麻廣慧
• 申請（專利權(quán)）人: 云南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A24B15/20;A62D3/02;C12R1/01;A62D101/26
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一株蒼白桿菌及其應(yīng)用，屬應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)：

煙堿是普通煙草中的生物堿，俗稱尼古丁(Nicotine)。是多種煙草的主要生物堿。人類長期保持著吸食煙草的習慣，然而，長期吸煙會導致對尼古丁的依賴性，而過量吸入尼古丁則會抑制中樞神經(jīng)，麻痹心臟，甚至有致命的危險。?

目前，我國烤煙煙堿含量偏高，尤其上部烤煙更加明顯，煙堿達到3％～4％，白肋煙煙堿含量甚至高達6％，而美國烤煙的煙堿含量在1.5％～3.5％之間，其白肋煙的煙堿含量約2.9％。一般優(yōu)質(zhì)白肋煙的煙堿含量在1.5％～4.0％之間，以3.0％為佳。國內(nèi)卷煙企業(yè)儲存的上部烤煙較多，因其煙堿含量較高而難以較多用于葉組配方中，造成巨大的浪費。?

尼古丁有很好的水溶性，能夠非常容易的穿過生物膜和血腦屏障。在煙草加工過程中存在大量富含尼古丁等煙堿化合物的固體和液體廢棄物，易進入地下水，給人們的生存環(huán)境帶來了極大威脅。1994年，美國環(huán)保總局將尼古丁定義為“有毒的危險廢棄物”。因此，從煙草廢棄物中去除尼古丁或者將這些廢棄物轉(zhuǎn)化成有價值的化合物是十分必要的。煙草科學研究合作中心提出“處理煙草廢物”，并總結(jié)了很多處理方法，微生物處理方法是其中建議的快速處理煙草廢物的方法之一。很多微生物能夠生長在煙葉及附近土壤中，并利用尼古丁作為唯一碳氮源和能源。在煙草加工過程中這些微生物能改善尼古丁含量，并能提高煙葉的品質(zhì)，也可分解煙草生產(chǎn)過程制造的廢棄物中的尼古丁，減少其對環(huán)境的污染等優(yōu)點具有重要的作用。?

關(guān)于利用微生物降解尼古丁的研究已有報道。但經(jīng)文獻檢索，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻的公開報道。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一種根瘤菌及其應(yīng)用，能夠有效降低煙草中尼古丁的含量。?

本發(fā)明從云南省紅河州彌勒縣多年種植煙草的土壤樣品中分離了一株具有降解尼古丁能力的細菌4-40，對其進行了形態(tài)學、生理生化性質(zhì)和16S?rRNA分析，鑒定結(jié)果表明該細菌屬于蒼白桿菌屬，該菌株命名為蒼白桿菌(Ochrobactrum?sp.)4-40。該菌株已經(jīng)保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：中國.北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2011年11月3日；保藏號為CGMCC?No.5442。

蒼白桿菌4-40菌株的主要形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)為：?

蒼白桿菌4-40菌落邊緣整齊、呈乳白色、粘稠。在顯微鏡下觀察為短桿狀，革蘭氏染色為陰性。硝酸鹽還原和苯丙氨基脫氨酶試驗為陽性。不能液化吲哚，不能水解淀粉。甲基紅(MR)實驗為陰性，乙酰甲基甲醇(V-P)實驗為陽性。本菌株對葡萄糖和甘露醇發(fā)酵產(chǎn)酸，乳糖和蔗糖發(fā)酵不產(chǎn)酸。?

蒼白桿菌4-40菌株的分子鑒定特征為：利用通用引物20F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1500R(5’-GGTTACCTTGTTACGA?CT-3’)，以蒼白桿菌4-40的基因組DNA作為模板擴增得到1500bp左右的PCR產(chǎn)物，回收測序、校正之后得到的4-40菌株的部分16S?rRNA基因序列1487bp，該序列已經(jīng)遞交國際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(GenBank)，序列的索引號為：JN700178。?

本發(fā)明按常規(guī)方法用常規(guī)設(shè)備制備。即將蒼白桿菌4-40擴大發(fā)酵培養(yǎng)后得到。?

本發(fā)明的蒼白桿菌4-40應(yīng)用于制備降低煙草中尼古丁含量的生物催化劑中。?

本發(fā)明具有能調(diào)整煙葉原料中尼古丁的含量，提高煙葉的品質(zhì)，也能分解煙草生產(chǎn)過程制造的廢棄物中的尼古丁，減少其對環(huán)境的污染的優(yōu)點。?

附圖說明：

圖1為蒼白桿菌4-40耐受尼古丁的濃度實驗結(jié)果。?

圖2為蒼白桿菌4-40降解尼古丁的生長曲線。?

具體實施方式：

以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。?

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：?

1.蒼白桿菌4-40菌株的培養(yǎng)方法：?

1)試管斜面培養(yǎng)?

采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，配方為(克/升，g/v)：10克蛋白胨，10克氯化鈉，5克酵母提取物，20克瓊脂，蒸餾水定容到1000毫升。121℃滅菌25分鐘，擺成斜面。接種蒼白桿菌4-40，28℃培養(yǎng)24小時，獲得試管種。?

2)液體擴大培養(yǎng)?