[發明專利]用于PCR檢測植物病害的內參基因的引物及其應用

無效

• 申請號: 201110388017.5
• 申請日: 2011-11-30
• 公開（公告）號: CN102367485A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發明（設計）人: 王恒波;郭晉隆;黃國強;許莉萍;陳平華;陳如凱
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明具體涉及一種用于PCR檢測出入境檢驗檢疫植物病害中外源基因的內參基因的引物及其應用。屬于生物工程技術領域。

背景技術

隨著經濟全球一體化的逐步加深，世界各國及地區間經濟關系密不可分，尤其是我國加入WTO后，國內外農產品貿易量的劇增，農作物檢疫性有害生物入侵的速度和防控的難度都在不斷加大，尤其是農業植物病害方面檢疫，面臨著巨大的挑戰。由檢疫性有害生物引起的災害，其危害往往比氣象災害更為嚴重，防控不及就有可能造成嚴重損失。遵照SPS協定科學性、風險管理、透明度、非歧視、等同性等原則，我國已相繼對小麥、馬鈴薯、水果等市場解禁，大量疫麥、疫豆、高風險水果進入我國，加之對境外引種、邊貿和走私等，以及在檢疫上存在薄弱環節和系統檢疫能力尚不夠強大，致使疫情傳入擴散的風險和疫情防御的難度越來越大，因此，植物病害檢疫面臨巨大挑戰。

截止2007年底，我國已發現檢疫性有害生物46種，20世紀70年代發現1種，80年代發現2種，90年代發現9種，近年新發現25種，僅2006?年就新發現5種。每年因生物災害造成的農作物產量損失在10%?左右，經濟損失達600?多億元。2007年3月，受起源于巴拿馬的香蕉鐮刀菌枯萎病的嚴重威脅，廣東、海南、廣西和福建香蕉產業遭到重創，2008年四川省廣元市旺蒼縣發生的柑橘大實蠅，在全國不少地方導致柑橘嚴重滯銷，給果農造成嚴重經濟損失。為了防止更為嚴重的外來疫害的威脅，國家對外來有害生物侵入以及造成的嚴重危害更加重視，相繼出臺了若干相關的法律法規，強化對有害生物的檢疫檢驗工作，我國各出入境口岸及產地植物病害檢疫檢驗迫切要求高效、特異、靈敏、快捷簡便的診斷方法。因此，國家質檢總局連續頒布了幾十種農業植物病害PCR檢測方法。比如：SN/T?1135.4-2006?馬鈴薯黑粉病菌檢疫鑒定方法、SN/T?2071-2008?亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法、SN/T?1465-2004?西瓜細菌性果斑病菌檢疫鑒定方法、SN/T?1813-2006?蝴蝶蘭細菌性軟腐病菌檢疫鑒定方法、SN/T?1390-2004?香蕉細菌性枯萎病菌檢疫鑒定方法、SN/T?2614-2010?葡萄苦腐病菌檢疫鑒定方法等等。?

聚合酶鏈式反應技術（polymerase?chain?reaction，簡稱PCR技術）由于具有耗時短、特異強、靈敏高等特點，而成為目前植物病害檢驗檢疫最廣泛使用的技術之一。由于PCR技術靈敏度高，容易出現假陽性、假陰性的檢測結果，因此，在檢測過程中，通常要設立多種的對照來監控操作PCR過程，包括：內參DNA對照、陽性目標DNA對照、陰性目標DNA對照、PCR抑制對照、擴增試劑對照、提取空白對照、陽性提取對照、環境對照。從而排除PCR檢測過程中可能出現的假陽性、假陰性結果。其中，內參DNA對照的設立是為了衡量模板DNA質量，是否適合進行PCR檢測，從而排除由模板中含有的雜質造成的假陰性檢測結果（即陰性檢測結果并不是因為樣品中不含有外源DNA模板，而是因為DNA模板中存在抑制PCR擴增因子）的一個強有力依據。以現有報道，僅僅發現水稻的植物病害檢測一般選擇SPS基因為內參基因，大豆一般選擇Lectin?基因為內參基因，玉米的檢測一般選擇IVR基因或者zSSⅡb基因為內參基因，而其他植物病害檢測內參基因未見報道。隨著進出口植物種類的增多，一種植物病害檢測對一種植物內參基因選擇的方法越來越不切實際，不僅降低了工作效率而且增加檢測的成本和檢測的時間，這對檢測任務重、工作量大檢驗檢疫部門來講更是增加了不少麻煩。因此，很有必要建立一個通用的植物內參基因檢測引物，以滿足多種多樣進出口植物相關病害檢測時內參基因需要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于PCR檢測植物病害的內參基因的引物，用于出入境植物寄生病害檢測過程中PCR模板的評價。

本發明的目的是這樣實現的：

本發明以NCBI公布的植物上葉綠體比較保守的功能基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基基因，根據已報道的30余種植物的rbcL基因序列表明，其編碼區具有高度的保守性。下載已經克隆測序的rbcL基因序列，然后利用DNAMAN進行序列比對根據保守區設計定性PCR檢測引物。

1.?其特征在于：所述定性PCR檢測正向引物序列為5’-TATCTTGGCAGCATTCCGAGTA-3’，反向引物序列為5’?–ACCCTCTTCAAATAGGTCTAATGG-3’。

2．所述引物特異性的擴增rbcL基因的228bp的DNA片段，用于出入境植物寄生病害檢測過程中PCR模板的評價。