[發明專利]用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片及其檢測方法

有效

• 申請號: 201110386942.4
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102373303A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 李應國;王國民;丁森;王昱;聶福平;肖進文;楊俊
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C40B40/06;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明屬于生物芯片領域。具體而言，本發明涉及一種羊痘病毒屬病毒（包括山羊痘病毒、綿羊痘病毒及牛疙瘩皮膚病病毒）的芯片檢測裝置。

背景技術

羊痘病毒屬病毒能引起山羊、綿羊和牛的皮膚、器官表面廣泛性結節和水腫，病畜產乳量急劇減少，皮毛品質極大下降，造成巨大經濟損失。山羊痘、綿羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。綿羊痘和山羊痘，被我國列為一類傳染病，對畜牧業養殖影響重大。據不同毒株的毒力差異，易感羊群的致死率可達10%～58%或?75%～100%不等。羔羊致死率可達?100%，妊娠母羊極易流產。同時，因自由貿易受到限制造成了國家稅收的下降，致使此病也成為了重要的經濟疾病。該病呈世界性分布，我國近年來在如廣西、貴州、黑龍江、甘肅等地也有發生。牛疙瘩皮膚病病毒引起牛的疙瘩皮膚病，又稱牛結節性皮炎或塊狀皮膚病，是以患牛發熱、皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結節，淋巴結腫大，皮膚水腫為特征的傳染病，能引起感染動物消瘦，產乳量大幅度降低，嚴重時導致死亡。被世界動物衛生組織（OIE）列為必須通報的動物疫病，感染率為5%～85%，病死率為10%。

此外，本病在公共衛生方面也有一定的意義，印度和斯堪的納維亞都有人類感染羊痘病毒的報道。在印度，管理患病動物的人有的手和腿上發生紅色丘疹，繼而出現水皰并結痂，但未見有全身性的擴散。張瑞陽等（2003）首次報道了我國人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面頰等部位出現丘疹。

山羊痘、綿羊痘和牛疙瘩皮膚病病毒很強的宿主特異性，自然條件下，不會發生交叉感染。本病毒對上皮細胞有特殊親和力，因此無論通過哪種途徑進入機體的病毒，最終都經血液達到皮膚和粘膜，在上皮細胞內增殖，引起一系列的炎癥過程而發生特異性的痘疹。山羊和綿羊均為易感動物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑隨風和灰塵吸入呼吸道而感染，也可以通過損傷的皮膚及消化道傳染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破潰后可從鼻、口分泌物和淚液排泄病毒。病毒進入乳汁、尿液和精液也可成為病毒傳播的重要來源。被病羊污染的用具、飼料、墊草，病羊的糞便、分泌物、皮毛和體外寄生蟲（如羊虱）都可以成為傳播媒介。該病以春秋兩季多發，主要在冬季春初流行，常呈地方性或廣泛流行。氣候嚴寒、雨雪、霜凍、枯草和飼養管理不良等因素都有助于本病的發生和加重病情。目前控制該病最有效的方法還是使用高效疫苗對易感動物進行免疫接種。

綜上所述該病毒的檢測對動物飼養和人類健康有重要的意義。利用基因芯片檢測羊痘病毒屬病毒具有快速、敏感、特異、高通量和自動化的優點。在對食品安全和出入境的快速檢測中起著重要作用，同時還可以減少該病毒的傳播。

牛疙瘩皮膚病病毒是引起牛疙瘩皮膚病的一種病毒。只要是病毒都可能存在變異的，牛疙瘩皮膚病病毒野毒株是指從自然發病的動物上分離的牛疙瘩皮膚病病毒，與標準毒株之間可能存在個別堿基的突變。牛疙瘩皮膚病病毒疫苗株是目前非洲地區以及其它地區，需要給牛注射疫苗，而選用的牛疙瘩皮膚病病毒經典毒株制備疫苗，通常稱該毒株為疫苗株。本發明涉及的毒株均為已知，例如牛疙瘩性皮膚病疫苗株Neethling?vaccine?LW?1959株購自南非(Bio?Onderstepoort，批號：8545)，牛疙瘩性皮膚病野毒株Neethling?2490株基因組DNA已由法國某生物實驗室公布，由病毒基因組ORF132基因的克隆測序結果可知，兩者的同源性為：97.93%。

發明內容

本發明的目的是建立一種靈敏度高、特異性強、節時省力并且易于觀察結果的微陣列芯片檢測羊痘病毒屬三種病毒的基因芯片。

為了實現上述目的本發明采用如下技術方案：用于羊痘病毒屬病毒鑒定的基因芯片檢測裝置，包括：PCR反應混合液管、Taq聚合酶、PCR陽性對照、PCR陰性對照、ddH₂O、檢測芯片、芯片探針的點樣分布、山羊痘病毒兩條檢測探針的核苷酸序列、綿羊痘病毒兩條檢測探針的核苷酸序列、疙瘩皮膚病病毒疫苗株兩條檢測探針的核苷酸序列、疙瘩皮膚病病毒野毒株兩條檢測探針的核苷酸序列、芯片蓋片、雜交液、雜交陽性對照、雜交盒。

采用基因芯片微量點樣技術，將待測樣品探針與各種質控探針固定在經過化學修飾的基片上，形成的微陣列。微陣列包括質控探針區和待測樣品探針區，其中所述質控探針區內設置下述分區：

點樣位置質控分區P1，包含至少一個點樣位置質控探針：SEQ?ID?NO9；

雜交陽性質控分區P2，包含至少一個雜交陽性質控探針：SEQ?ID?NO10；

雜交陰性質控分區N，包含點樣緩沖液；