[發(fā)明專利]用于平菇遺傳轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110386595.5
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102492690A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許峰;劉宇;王守現(xiàn);尹永剛;趙爽;王鵬;王蘭青;耿小麗;孟莉莉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/82;A01H15/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于平菇遺傳轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

平菇(Pleurotus?ostreatus)又名糙皮側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門(Basidio?mycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，無隔擔(dān)子菌亞綱(Homobasidiomy?cetidae)，傘菌目(Agaricales)，側(cè)耳科(Pleurotaceae)，側(cè)耳屬(Pleurotus)，是目前我國最豐富的真菌種類資源之一。平菇產(chǎn)量高、生長速度，營養(yǎng)豐富，且具有一定的藥用功效，再加上可利用的栽培基質(zhì)豐富多樣，使得平菇成為研究食用菌生理生化和遺傳的較好的模型。

通過分子生物學(xué)技術(shù)，根據(jù)市場需求及時(shí)、定向培育出高質(zhì)量的新菌株，通過基因工程手段導(dǎo)入外源基因進(jìn)行食用菌的遺傳轉(zhuǎn)化，使其子實(shí)體具有相應(yīng)目的性狀，是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢。另外相對于動植物而言，食用菌分子生物學(xué)研究工作起步較晚，同時(shí)由于市場的狹小和缺少對食用菌研究的大量投資，導(dǎo)致食用菌分子生物學(xué)研究滯后。高效安全的食用菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立是從事分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。平菇高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，將為其遺傳發(fā)育機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)，為其分子育種提供技術(shù)支持，為新型生物反應(yīng)器的研發(fā)提供儲備，為平菇及其生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供前提條件，具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于平菇遺傳轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種DNA片段，自上游至下游依次包括啟動子(平菇三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子)和終止子(平菇三磷酸甘油醛脫氫酶基因終止子)；所述啟動子的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述終止子的核苷酸序列如序列表的序列2所示。

所述DNA片段還包括抗性篩選基因。所述抗性篩選基因具體可為序列表的序列3所示的hph基因。

所述DNA片段可用于制備轉(zhuǎn)基因平菇。

含有所述DNA片段的重組質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒甲)可為在pUC19質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)間自上游至下游依次插入所述啟動子和所述終止子得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒優(yōu)選為將pUC19質(zhì)粒Sph?I和Sal?I酶切識別序列之間的小片段取代為所述啟動子，BamH?I和Sac?I酶切識別序列之間的小片段取代為所述終止子得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)在所述重組質(zhì)粒甲的所述啟動子和所述終止子之間插入含有外源基因的DNA片段得到的重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒乙)。所述含有外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和抗性篩選基因。所述抗性篩選基因具體可為序列表的序列3自5’末端第763-1793位核苷酸所示的hph基因。所述外源基因具體可為序列表的序列3自5’末端第1-726位核苷酸所示的egfp基因。所述含有外源基因的DNA片段具體可為序列表的序列3所示的DNA片段。

所述重組質(zhì)粒可用于制備轉(zhuǎn)基因平菇。

用所述重組質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)基因平菇的方法可為：將所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒乙)轉(zhuǎn)化平菇的原生質(zhì)體，培育后得到轉(zhuǎn)基因平菇。所述轉(zhuǎn)化具體可通過PEG/CaCl₂介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)。

用所述重組質(zhì)粒制備轉(zhuǎn)基因平菇的方法可包括如下步驟：

(1)用溶壁酶裂解平菇菌絲，得到原生質(zhì)體；

(2)將所述重組質(zhì)粒(重組質(zhì)粒乙)導(dǎo)入所述原生質(zhì)體，培育后得到轉(zhuǎn)基因平菇。

所述步驟(1)具體可為：將平菇菌絲懸浮于1.5g/100mL的溶壁酶溶液，32℃、60rpm溫浴30小時(shí)，過濾并收集濾液，然后將所述濾液3000rpm離心10min并收集沉淀，然后將所述沉淀洗滌后懸浮于MMC緩沖液中，即為原生質(zhì)體溶液。

MMC緩沖液由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為50mM馬來酸緩沖液(pH?5.5)；所述溶質(zhì)及其在MMC緩沖液中的濃度如下：0.5M甘露醇、5mM?CaCl₂。

所述步驟(2)可為：將步驟(1)的原生質(zhì)體、所述重組質(zhì)粒、金精三羧酸、亞精胺和肝素在PTC緩沖液中混合均勻，依次進(jìn)行冰浴和室溫靜置，離心收集沉淀。

所述步驟(2)具體可為：將70μl步驟(1)得到的原生質(zhì)體溶液、20μg重組質(zhì)粒(具體可為10μl?2μg?μl^-1的重組質(zhì)粒溶液)、10μl?20mM金精三羧酸水溶液、5μl?50mM亞精胺水溶液和5μl?20mg/ml肝素水溶液震蕩混勻，然后加入50μlPTC緩沖液并震蕩混勻，然后冰浴25min，然后加入1ml?PTC緩沖液后室溫靜置20min，3000rpm離心10min，收集沉淀。