[發明專利]一種木瓜蛋白酶的純化方法

無效

• 申請號: 201110385574.1
• 申請日: 2011-11-28
• 公開（公告）號: CN102392009A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 汪洋;馬賢鵬;錢正祥
• 申請（專利權）人: 上海景峰制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

技術領域：

本發明涉及一種木瓜蛋白酶的純化方法。

背景技術：

木瓜蛋白酶是存在于木瓜果實中的一種半胱氨酸蛋白酶，由212個氨基酸殘基組成，并含有3對二硫鍵。它的三維結構是由兩個不同的結構域所組成，兩個結構域之間形成一個縫隙；縫隙內含有酶的活性位點，包括一個與胰凝乳蛋白酶中所含的相似的催化三聯體。木瓜蛋白酶中的催化三聯體由25位的半胱氨酸(Cys-25)、159位的組氨酸(His-159)和158位的天冬酰胺(Asn-158)這三個氨基酸所組成。木瓜蛋白酶的剪切肽鍵的機制包括：在His-159作用下Cys-25去質子化，而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環的擺放，使得去質子化可以發生；然后Cys-25親核攻擊肽主鏈上的羰基碳，并與之共價連接形成酰基-酶中間體；接著酶與一個水分子作用，發生去酰基化，并釋放肽鏈的羰基末端。

值得注意的是酶解劑應控制其微生物限度和內毒素，以控制生物指標，目前國內的木瓜蛋白酶基本為食品級，在醫藥行業使用往往需要控制其內毒素和微生物，直接出售的木瓜蛋白酶很難符合藥用標準，所以在使用時必要的純化工藝是必須的，以往的公開的文獻中，木瓜蛋白酶的制備方法一般是烘干，噴霧干燥與凍干，只有簡單的純化工序，這種缺點是：

1.生產環境與作業方式決定了細菌不能被有效控制。

2.菌落數超標后采用鈷60輻照的方式進行滅菌，但會帶來內毒素的升高，同時酶解力會下降。

3.生產工藝中對內毒素不做控制。

發明內容：

本發明的目的是提高一種木瓜蛋白酶的純化方法，以克服木瓜蛋白酶原生產工藝方法中的不足，本方法純化所得的木瓜蛋白酶雜質含量少，尤其是木瓜蛋白酶中的內毒素和細菌含量明顯減少。

為實現本發明的目的，本發明所采用的技術方案是：

一種木瓜蛋白酶的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將木瓜蛋白酶溶解于水中，攪拌至溶解完全后，加入活性炭和硅藻土，充分攪拌后，進行脫碳循環至木瓜蛋白酶溶液澄清；

(2)使用濾芯進行除菌過濾。

在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，所述水是注射用水，其用量是木瓜蛋白酶重量的25-35倍。

在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，所述活性炭是針用活性炭，其用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。

在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，硅藻土的用量是木瓜蛋白酶重量的30-40倍。

在本發明的一優選實施例中步驟(1)中，用鈦棒進行脫碳循環。

在本發明的一優選實施例中步驟(2)中，所述濾芯為0.45+0.22μm。

本發明的純化方法將木瓜蛋白酶預溶于注射用水中，進行活性炭吸附，硅藻土助濾后再經濾芯進行過濾所得的木瓜蛋白酶雜質含量少，尤其是木瓜蛋白酶中的內毒素和細菌含量明顯減少，酶活力高。

具體實施方式：

通過下面給出的本發明的具體實施例可以進一步清楚地了解本發明，但它們不是對本發明的限定。

實施例1

將3kg木瓜蛋白酶溶解于90kg注射用水中，攪拌30分鐘至溶解完全后，加入135g針用活性炭，135g硅藻土，充分攪拌2小時后，用單芯10μm鈦棒進行脫碳循環至藥液澄清，使用0.45μm+0.22μm濾芯進行除菌過濾，過濾結束后，將木瓜蛋白酶過濾液進行真空低溫干燥后送檢，檢驗項目為細菌內毒素，無菌，酶活力。

將實施例1重復做3次，得到三批樣品，對其進行細菌內毒素，無菌，酶活力的檢測結果見表1

表1：

如上表可見，木瓜蛋白酶經過處理后內毒素水平平均下降50％，經過0.22μm濾芯除菌過濾后，細菌均未檢出，酶活力由于木瓜蛋白酶粗品進行過濾純化處理，將原有木瓜蛋白酶中的一些雜質去除，使得木瓜蛋白酶的純度得到提高，酶活力也同步得到了提高，說明在不影響木瓜蛋白酶的酶活性質的同時，對原有的內毒素和細菌含量都得到了有效的控制，在目前市場上以食用級木瓜蛋白酶為主的情況下，通過二次處理，在源頭上對內毒素及細菌加以控制，為后續的藥品生產質量提供更高的保證，有著良好的經濟效益和社會效益。

盡管對本發明已經作了詳細的說明并引證了一些具體實施例，但對本領域熟練技術人員來說，只要不離開本發明的精神和范圍可作各種變化和修正是顯然的。