[發明專利]一種制備轉基因豬精子的方法

無效

• 申請號: 201110385565.2
• 申請日: 2011-11-29
• 公開（公告）號: CN102559751A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 孫金海;吳明明;崔海信;李奎
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;A61D19/02;A01K67/027
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技術領域：

本發明涉及一種制備轉基因豬精子的方法，特別涉及磁性納米顆粒介導的制備轉基因豬精子的方法。

背景技術：

轉基因技術開始于20世紀80年代，目前，轉基因技術主要有顯微原核注射法，逆轉錄病毒感染法，胚胎干細胞介導法，體細胞核移植技術，精子載體法，胞漿內單精子注射法，卵母細胞載體法等。

精子載體法是將精子作為外源基因的載體，在受精過程中將外源基因導入動物胚胎，并使外源DNA整合到染色體中，從而使外源基因進入子代的基因組中目前，應用精子為載體介導基因轉移獲得轉基因動物主要通過以下途徑來實現的：體外精子轉染法和體內精子轉染法體外精子轉染法又可以分為精子與外源DNA直接共孵育法，體外電穿孔導入法和脂質體介導轉染法；體內精子轉染法又可以分為輸精管注射轉染法、曲細精管注射轉染法、睪丸注射轉染法等。1971年，Bracket等首次證實精子具有吸附結合外源DNA能力，并將外源DNA在受精時攜帶進入卵母細胞。1992年，Lavitrano等應用此法得到陽性轉基因小鼠，并發現成熟精子頭部具有吸收外源DNA的能力，其吸收區域是具有特異性的，該區域位于精子頭部的頂體后區(post-acrosomal?region)，即靠近精核的區域。沈新明等直接用人巨細胞病毒啟動子調控的增強型綠色熒光蛋白表達載體注射到小鼠的曲精細管內，最后通過與雌鼠交配，成功獲得了表達綠色熒光蛋白的轉基因仔鼠。袁進等報道向通過向曲精細管內注射外源DNA，然后再結合對曲精細管電擊或電穿孔處理，以使外源基因進入睪丸生精細胞然后將這些處理的雄鼠與母鼠交配，得到的小鼠中有一組的陽性檢測率達25％。Shen等則將處理方法更為簡化，首先直接向雄兔睪丸內注射攜帶綠色熒光表達的外源DNA及二甲基亞楓的介質，使DNA能夠進入睪丸細胞和生精細胞。一個月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產生后代的56％仔兔能高效地表達所導入的外源基因。這一轉入外源基因的陽性率大大高于以往精子載體法或其他非定點轉基因方法的結果。李碧春等以重組的綠色熒光蛋白基因為標記，首次在家雞上通過采用公雞睪丸內轉染精原干細胞(spermatogonial?stem?cells，SSCs)和體外轉染SSCs再移植的方法成功地生產出了轉基因雞，并且在家鴨和家雞上轉染功能基因進行驗證，結果均說明該方法無需特殊的儀器要求，即可完成轉染外源基因的過程，方法簡單，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生產轉基因雞群，該方法的建立在家禽上意義重大，突破了制約家禽轉基因生產的瓶頸，解決了家禽轉基因難的問題，特別是體外轉染移植的成功，不僅解決了家禽轉基因難的問題，而且為成體干細胞的應用開辟了更廣闊的應用前景。