[發明專利]一種昆蟲基因檢測方法

無效

• 申請號: 201110385101.1
• 申請日: 2011-11-28
• 公開（公告）號: CN102392078A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 張帥;崔金杰;雒珺瑜;王春義;呂麗敏;馬艷;蔣偉麗
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 武晶晶;楊淑媛

技術領域

本發明涉及一種昆蟲基因檢測方法，更具體地涉及一種基于昆蟲卵的基因檢測方法。

背景技術

昆蟲是動物界中無脊椎動物的節肢動物門昆蟲綱的動物，是所有生物中種類及數量最多的一群，是世界上最繁盛的動物，至今已發現100多萬種。昆蟲之所以能夠長久興旺的存在于地球之上，與其基因突變個體的大量存在不無關系?；蛲蛔儌€體的大量存在給昆蟲生存提供機會，但也給農業生產帶來麻煩。由于昆蟲個體變異迅速，造成農業生產中常用的農藥在使用過程中由于抗藥性個體的迅速出現，而大大縮短了該種農藥的使用壽命。在抗蟲植物的推廣過程中也存在同樣的問題。對昆蟲基因突變個體實時監測，有利于延長農藥和抗蟲植物的使用年限。

現在對昆蟲基因突變個體的監測一般通過生物測定和分子檢測技術，相對于分子檢測，生物測定技術耗時耗力?，F如今的分子檢測一般通過PCR檢測或芯片技術。使用PCR技術首先要提取昆蟲的基因組DNA，設計基因檢測引物，使用昆蟲的基因組DNA作為模板進行PCR反應，對PCR產物進行分析，根據擴增片段的大小或序列測定進行昆蟲基因變異情況的判斷。基因芯片是指通過微電子技術和微加工技術將大量特定序列的DNA探針(片段)有序地固定在載體表面，從而形成貯存有大量信息的DNA芯片。與待測樣品DNA作用后，即可在短時間內快速準確地獲取樣品中的基因突變信息?；蛐酒枰獙Ｓ玫膬x器設備，價格昂貴，且對技術要求較高。這些技術都需要提取DNA，由于昆蟲卵相對較小，DNA含量低，DNA提取十分困難，所以DNA提取過程中一般使用昆蟲的幼蟲或成蟲。而提取DNA的時候要殺死昆蟲，造成該品系昆蟲無法繼續繁殖后代，影響對該品系昆蟲的其他方面研究。

因此，有必要提供一種成本低、靈敏度高的用于大規模昆蟲基因檢測的方法。

發明內容

本發明提供了一種昆蟲基因檢測方法，其使用昆蟲卵作為檢測對象，以雜交膜為載體，利用Southern雜交技術，使用標記的目標探針檢測昆蟲卵中的DNA。

本發明所述的昆蟲基因檢測方法包括以下步驟：

(1)將單個或多個昆蟲卵分別破碎于雜交膜上；

(2)使用裂解液處理步驟(1)獲得的雜交膜上的破碎的昆蟲卵；

(3)將步驟(2)獲得的雜交膜在2×SSC溶液中清洗；

(4)將步驟(3)獲得的雜交膜烘干以固定DNA；

(5)將步驟(4)獲得的雜交膜置于雜交袋中，作標記，將預熱的雜交液加入雜交袋中，將雜交袋內的空氣排空并將雜交袋密封，然后將密封的雜交袋放入雜交爐中預雜交0.5-4小時；

(6)對步驟(5)獲得的雜交膜根據目標探針標記類型進行Southern雜交檢測。

上述昆蟲基因檢測方法中，步驟(1)所述雜交膜可為尼龍膜，所述多個昆蟲卵可通過施加機械壓力的方式被破碎于所述雜交膜上。

步驟(2)所述的裂解液包括氯化鈉100mmol/L、Tris-HCl?10mmol/L、EDTA?50mmol/L、SDS?0.5％(w/v)、蛋白酶K?2-4mg/ml，所述裂解液的pH值為7.4。步驟(2)的處理溫度可為65℃，處理時間可為0.5-2小時(優選1小時)。

步驟(3)所述2×SSC溶液包括氯化鈉0.3mol/L、檸檬酸鈉0.03mol/L，所述2×SSC溶液的pH值為7.0。步驟(3)的清洗次數可為2次，每次10分鐘，并于清洗時不斷搖動雜交膜。

步驟(4)的烘干方式可包括以下方式的任意一種：于烘箱中在120℃下烘30分鐘，在80℃下于真空中烘2小時，經254nm紫外光照射2分鐘。

步驟(5)所述的雜交液包括6×SSC，5×Denhardt，0.5％(w/v)SDS和100μg/ml的鮭魚精DNA，所述雜交液加入雜交袋的比例可為8-12mL/100cm²(優選10mL/100cm²)，所述預熱溫度可為42℃，所述密封的雜交袋在雜交爐內的預雜交溫度可為42℃。

步驟(6)所述目標探針用帶有標記物的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸標記，步驟(6)包括用酶化學法檢測所述Southem雜交的結果。

本發明所述的昆蟲基因檢測方法成本低、靈敏度高，可用于大規模的昆蟲DNA檢測。