[發明專利]利用代謝組學改進微藻培養條件以提高產油能力的方法

有效

• 申請號: 201110384759.0
• 申請日: 2011-11-28
• 公開（公告）號: CN102517349A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 英進;陸姝歡;楊潔;牛艷紅
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;G01N30/02;C12R1/89
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.利用代謝組學改進微藻培養條件以提高微藻產油能力的方法，其特征是包括如下步驟：

(1)對微藻胞內的代謝物進行測定：

①細胞收集及淬滅：

對微藻進行培養，在培養過程的指數中期、后期和穩定期三個時間的至少一個時間點取出藻液樣品100-150mL，每個時間點取出3-5份，4℃下3000-5000rpm，離心3-4min，收集下層的細胞，用3-5mL代謝終止液在-40℃下淬滅5-10分鐘，終止代謝反應，在-80℃下冷凍干燥4-6h獲得凍干細胞；

所述代謝終止液為含有1500mg·L^-1NaNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，75mg·L^-1MgSO₄·7H₂O和40mg·L^-1K₂HPO₄·3H₂O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1∶2；

②提取細胞內代謝物：

取步驟①獲得的凍干細胞15-25mg分別置于離心管中，每管加入1-2mL-40℃的代謝提取液，混勻，蓋緊并放入液氮中，反復凍融3-5次，在-20℃下4000-6000rpm離心1-2min，收集上清，另向殘渣中加入0.5-1mL代謝提取液，-20℃下4000-6000rpm離心1-2min，離心后，兩次上清液混合，加入10-20μg氘標記琥珀酸，得混合液，取200μL混合液，在-80℃下冷凍干燥2-4小時；

所述代謝提取液為體積百分含量為50％的甲醇水溶液；

③代謝物衍生化

向步驟②獲得的樣品中加入20mg·mL^-1的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液50μL，于40℃水浴中反應60-80min，反應結束后加入80μL?N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40℃水浴再反應60-80min，8000-12000rpm離心1min，取上清100μL放入已編號的GC進樣瓶，室溫放置2h；

④GC-MS檢測

采用GC-MS對步驟③所得樣品進行定性和定量處理，條件如下：

色譜柱：DB-5氣相色譜柱，其規格為30m*0.25mm，0.25μm；

進樣量：1μL；

分流比：10∶1；

進樣口溫度：280℃；

GC?interface溫度：270℃；

氦氣流速：恒壓，91KPa；

升溫程序：70℃保持2min，以5℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；

電離電壓：70eV；

源溫：250℃；

掃描范圍：50-800m/z；

掃描速度：2scan·s^-1；

從而獲得了微藻的代謝物定性和定量數據；

(2)對微藻的產油能力進行分析：

①細胞收集及淬滅：

對微藻進行培養，在培養過程的指數中期、后期和穩定期三個時間的至少一個時間點取出藻液樣品100-150mL，每個時間點取出3-5份，4℃下3000-5000rpm，離心3-4min，收集下層的細胞，用3-5mL代謝終止液在-40℃下淬滅5-10分鐘，終止代謝反應，在-80℃下冷凍干燥4-6h獲得凍干細胞；

所述代謝終止液為含有1500mg·L^-1NaNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，75mg·L^-1MgSO₄·7H₂O和40mg·L^-1K₂HPO₄·3H₂O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1∶2；

②提取細胞內脂肪酸：

取步驟①獲得的凍干細胞15-25mg分別置于離心管中，每管加入0.75-1.5mL氯仿及0.3-0.6mL超純水，100rpm震蕩1h；再加入2-4mL脂肪提取液，室溫下以100rpm震蕩0.5h，收集氯仿相；向殘渣中加入2-4mL脂肪提取液，室溫下以100rpm震蕩0.5h，收集氯仿相；反復提取3次，將氯仿相合并，加入0.5-1mL?1M?KCl水溶液，震蕩，3000-4000rpm，離心3-5min，棄水相，再加入1-2mL超純水，震蕩，3000-4000rpm，離心3-5min，棄水相，30-35℃真空干燥得干物質；

所述脂肪提取液為體積百分含量為66.7％的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液含有質量百分比為0.1％的二丁基羥基甲苯；

③脂肪酸甲酯化：

將所述干物質溶于600-1000μL質量百分比為14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入10-20μg十七烷酸做為內標，置于15mL密封管內，在100℃水浴20-30min，溫度降至室溫，加入500-1000μl正己烷震蕩萃取30s，4000-5000rpm離心2min，得到正己烷相；取100-200μL正己烷相放入已編號的GC進樣瓶；

④GC-MS檢測

采用GC-MS對正己烷相中的脂肪酸甲酯進行定性和定量處理，條件如下：

色譜柱：DB-5氣相色譜柱，其規格為30m*0.25mm，0.25μm；

進樣量：1μL；

分流比：10∶1；

進樣口溫度：280℃；

GC?interface溫度：270℃；

氦氣流速：恒壓，91KPa；

升溫程序：70℃保持2min，以8℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；

電離電壓：70eV；

源溫：250℃；

掃描范圍：50-800m/z；

掃描速度：2scan·s^-1；

從而獲得了脂肪酸甲酯混合物中的單個脂肪酸甲酯的含量；

⑤日產量

根據如下公式計算微藻脂肪酸甲酯混合物的日產量：

P＝∑Wi/Day/CV

其中P是微藻脂肪酸甲酯日產量，Wi是步驟④中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的重量，Day是步驟①所述從微藻接種到微藻收獲的時間長度，CV是步驟①所述收獲時微藻培養液的體積；

⑥十六烷值確定

根據如下公式計算微藻脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：

SN＝∑(560×Pi)/MWi?????????????a

IN∑(254×D×Pi)/MWi????????????b

CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN??????c

其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步驟④中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步驟④中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的分子量，D是步驟④中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的雙鍵數量。

(3)PLS分析

將步驟(1)獲得的微藻代謝物含量為自變量，將步驟(2)獲得的微藻脂肪酸甲酯日產量和十六烷值為因變量，使用PLS分析，得到與產油相關的代謝標志物；

(4)過程分析

將步驟(3)獲得的代謝物標志物的含量按照培養條件差異制成圖表，觀察并分析這些代謝物變化的規律，進而發現在微藻產油過程中起關鍵作用的代謝物及相關代謝網絡，從而為以提高微藻脂肪酸甲酯產量和質量為目的的微藻培養條件提供優化方向。

2.根據權利要求1所述的利用代謝組學改進微藻培養條件以提高微藻產油能力的方法，其特征是所述微藻為小球藻(Chlorella?sorokiniana)、柵藻(Scenedesmus?obliquus)、集胞藻(Synechocystis?sp.PCC6803)及魚腥藻(Anabaena?sp.PCC7120)。