[發(fā)明專利]小麥法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS及其分離克隆、酶活性測定方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110383608.3
• 申請日: 2011-11-28
• 公開（公告）號: CN102433349A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楚秀生;李玉蓮;李永波;樊慶琦;黃承彥;劉愛峰;高潔;隋新霞
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/79;C12Q1/48;G01N21/31;A01H5/00
• 代理公司: 濟南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種參與小麥葉綠素、類胡蘿卜素等類異戊二烯物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶基因法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的分離克隆、酶蛋白的原核表達(dá)、酶蛋白的分離純化及酶活性體外檢測技術(shù)。

背景技術(shù)

類異戊二烯物質(zhì)存在于所有生物體中，在植物中含量尤其豐富，是維持植物生長發(fā)育、光合作用等所必需的重要有機物質(zhì)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了3萬余種植物類異戊二烯，而且這個數(shù)字還在逐年增加。該類物質(zhì)在生物體中具有各種不同的作用，可作為光合色素(如葉綠素、類胡蘿卜素)、生長物質(zhì)和植物激素(細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內(nèi)酯)、膜結(jié)構(gòu)的一部分如谷甾醇、電子傳遞受體如質(zhì)體醌、作為葡萄糖基化反應(yīng)中葡萄糖的受體如多萜醇，并能調(diào)控細(xì)胞的生長(如異戊烯基蛋白，細(xì)胞分裂素)。此外，很多植物類異戊二烯還具有重要的商業(yè)價值如作為食物香料、飲料、維生素A、D、E，天然殺蟲劑如除蟲菊素和橡膠等。

類異戊二烯物質(zhì)的生物合成主要由甲羥戊酸途徑中的一系列酶酶促合成的，法呢基焦磷酸合酶(FPS；EC2.5.1.1/EC2.5.1.10)是該代謝途徑中分支點的關(guān)鍵酶，通過類異戊二烯1′-4順序縮合的方式催化異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)，首先形成櫳牛兒基焦磷酸(GPP)，然后與另一分子異戊烯焦磷酸縮合形成一個多分支點的、特別重要的中間產(chǎn)物法呢基焦磷酸(FPP)，是控制整個代謝途徑的限速酶之一。目前已分別從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza?sativa)、玉米(Zea?mays)、高粱(Sorghum?bicolor)、橡膠(Hevea?brasiliensis)等40種植物中分離克隆了法呢基焦磷酸合酶基因，在本發(fā)明申請之前，還沒有公開或發(fā)表過關(guān)于從小麥(Triticum?aestivum)中分離克隆法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS、編碼蛋白酶的原核基因表達(dá)、酶蛋白的分離純化及其酶活性體外檢測和動力學(xué)參數(shù)等研究資料信息。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中在小麥中法呢基焦磷酸合酶基因相關(guān)技術(shù)的缺失，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一整套關(guān)于小麥特別是品種“濟南13”法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS克隆、編碼蛋白酶的原核基因表達(dá)、酶蛋白的分離純化及其酶活性體外檢測和動力學(xué)參數(shù)測定的技術(shù)。測得自小麥品種濟南13克隆獲得的法呢基焦磷酸合酶對底物二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)、異戊烯焦磷酸(IPP)和櫳牛兒基焦磷酸(GPP)的V_max分別為22.7±1.5、73.5±16.9和73.0±10.8μmol/min/mg；K_M值分別為0.84±0.14、1.83±0.79和1.51±0.43μM；Kcat分別為1.67±0.11、5.42±1.25和5.38±0.80S^-1，Kcat/K_M分別為1.99x10⁶、2.96x10⁶和3.56x10⁶M^-1S^-1，由此證明克隆的小麥法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物學(xué)功能。本發(fā)明為進一步構(gòu)建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化相應(yīng)作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討法呢基焦磷酸合酶基因在受體植物中的過量表達(dá)與次生代謝產(chǎn)物、作物籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對法呢基焦磷酸合酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標(biāo)記提供重要技術(shù)儲備。

本發(fā)明提供的小麥法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS的編碼區(qū)基因序列如SeqID?No：1所示，其編碼的氨基酸序列如Seq?ID?No：2所示。

上述的小麥品種濟南13中的法呢基焦磷酸合酶基因TaFPS是從小麥品種濟南13中克隆獲得的，其中小麥品種濟南13中該基因cDNA總長為1399bp，翻譯起始密碼子ATG自49位核苷酸開始，終止密碼子TAG位于1111位核苷酸處，在1310位核苷酸處有polyA尾巴。因此，小麥品種濟南13TaFPS全長cDNA包括1個48bp的5′非編碼區(qū)、1065bp編碼區(qū)和1個257bp的3′非編碼區(qū)，編碼一條包含354aa的多肽，分子量約為42kDa，其基因序列及氨基酸序列如Seq?ID?No：3所示；

本發(fā)明的發(fā)明人提供了該基因的具體的分離克隆方法及其原核表達(dá)及酶活性檢測的方法為：

1.小麥葉片RNA的分離提取

根據(jù)Trizol試劑盒的說明書進行。獲得的RNA保存在DEPC水中備用。