[發(fā)明專(zhuān)利]利用脅迫發(fā)酵生產(chǎn)重組耐熱超氧化物歧化酶的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110383398.8
• 申請(qǐng)日: 2011-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103131680A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱虎;劉建國(guó);曲劍波;高欣良;潘濤;呂建仁
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)石油大學(xué)(華東)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/02
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，主要是應(yīng)用NH₄⁺和Mn²⁺脅迫發(fā)酵策略，發(fā)酵放大生產(chǎn)重組耐熱超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的方法，最高酶活可達(dá)489.18U/ml。?

背景技術(shù)

SOD是體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機(jī)體的氧自由基，從而避免當(dāng)體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過(guò)高時(shí)引起的不良反應(yīng)，同時(shí)SOD是一種很有用途的藥用酶。醫(yī)學(xué)界已經(jīng)證明它具有抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗缺血、提高人體免疫力等作用。目前SOD酶已作為一種保健醫(yī)藥產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飲料、化妝品等行業(yè)，具有非常廣闊的市場(chǎng)。?

熱變性是導(dǎo)致酶失活的常見(jiàn)原因，在實(shí)際應(yīng)用中，SOD的熱穩(wěn)定性是決定其能否商業(yè)化的一個(gè)主要因素。因此，從極端耐熱微生物中克隆SOD基因，然后在E.coli中重組表達(dá)，從而制備耐高溫SOD成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。用E.coli作為外源基因的原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組酶生產(chǎn)的主要目的，是獲取較高的細(xì)胞密度和高水平表達(dá)的重組酶。在大規(guī)模工業(yè)化的生產(chǎn)中，人們往往采用不同的分批補(bǔ)料方式、不同營(yíng)養(yǎng)要素的配比、控制相關(guān)發(fā)酵參數(shù)(溶氧、pH值、溫度)等手段，提高細(xì)胞密度，進(jìn)而提高重組酶的表達(dá)水平。但是，許多重組E.coli菌株在搖瓶培養(yǎng)時(shí)，其目標(biāo)酶的表達(dá)水平較高，但在發(fā)酵罐放大培養(yǎng)時(shí)，表達(dá)水平就下降了；在工業(yè)生產(chǎn)中重組菌株在低細(xì)胞密度時(shí)，表達(dá)水平較高，但在高密度培養(yǎng)時(shí)，表達(dá)水平就明顯下降了。為了避免和減少以上方法的缺陷，研發(fā)新型發(fā)酵調(diào)控策略，利用重組E.coli大規(guī)模生產(chǎn)耐熱SOD，將具有十分重要的意義。?

本發(fā)明首先從嗜熱棲熱菌Thermus?thermophilus?HB27中克隆SOD基因，構(gòu)建重組載體，實(shí)現(xiàn)耐熱Mn-SOD的異源表達(dá)；然后公開(kāi)了利用脅迫發(fā)酵技術(shù)放大生產(chǎn)重組耐熱Mn-SOD的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單，易于放大的脅迫發(fā)酵生產(chǎn)重組耐熱超氧化物歧化酶的方法。?

本發(fā)明采取的技術(shù)路線(xiàn)是：?

1.以嗜熱棲熱菌(T.thermophilus?HB27)基因組DNA為模板，采用PCR技術(shù)克隆SOD基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR?I和Sal?I雙酶切后，連接到經(jīng)同樣處理的pET28a⁽⁺⁾表達(dá)載體上，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pETSOD，將重組載體pETSOD導(dǎo)入大腸桿菌(E.coli?BL21(DE3))，獲得基因重組工程菌E.coli?BL21(DE3)/pETSOD。?

2.在LB培養(yǎng)基(含50μg/ml?kanamycin)或加糖LB培養(yǎng)基(含50μg/ml?kanamycin，10g/1glucose)中加入銨鹽或金屬離子，NH₄⁺或金屬離子的濃度分別為50～400和1～10mmol/L。所用的氨離子來(lái)源于過(guò)硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨、氯化銨、檸檬酸銨、硫酸銨；所用的金屬離子有Na⁺，K⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Cu²⁺，Cd²⁺，F(xiàn)e²⁺，F(xiàn)e³⁺，Sr²⁺，Al³⁺，Zn²⁺。?

3.將E.coli?BL21(DE3)/pETSOD培養(yǎng)3小時(shí)(37℃，200rpm)，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至濃度為1mM，培養(yǎng)溫度調(diào)至30℃，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。?

4.取步驟3得到的發(fā)酵液30ml，離心10min(離心條件為4℃，離心力為10,000×g)，用1M的TE?Buffer(pH?8.0)5-10ml清洗菌體，再離心15min，棄去上清液，加入1M的TE?Buffer(pH?8.0)3ml，混合均勻；用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)其進(jìn)行菌體破碎(超聲條件：聲波時(shí)間3s，間隔3s，次數(shù)99次)；超聲之后離心15min，取上清液測(cè)定酶活，SOD酶活采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。?