[發(fā)明專利]核酸內(nèi)切酶DUF820-2的原核表達(dá)與制備方法及應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110381716.7
• 申請(qǐng)日: 2011-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN102433350A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓家淮;徐虹;黃晶;吳娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/55
• 分類號(hào): C12N15/55;C12N15/10;C12N15/66;C12N15/70;C12N9/22;C12Q1/68;C12Q1/44;C12P19/34
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.核酸內(nèi)切酶DUF820-2基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：

1)根據(jù)核酸內(nèi)切酶的保守基序?qū)︺~綠微囊藻Microcystis?aeruginosa?PCC7806基因組序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域掃描，尋找具有核酸內(nèi)切酶保守基序的蛋白，并對(duì)具有核酸內(nèi)切酶保守基序的蛋白的序列進(jìn)行分析，得到屬于DUF820超家族的3個(gè)功能未知蛋白具有核酸內(nèi)切酶的保守結(jié)構(gòu)域，這3個(gè)蛋白分別命名為DUF820-1、DUF820-2和DUF820-3，所述DUF820-2蛋白含193個(gè)氨基酸，分子量為22.4，在GenBank中的登陸號(hào)為CAO88485.1，基因登陸號(hào)為AM778958.1，基因位置標(biāo)簽為IPF_1408，其基因序列見附錄序列表中第1個(gè)DNA序列，氨基酸序列見附錄序列表中第2個(gè)序列；

2)核酸內(nèi)切酶DUF820-2基因的擴(kuò)增，具體方法如下：

根據(jù)DUF820-2的基因序列設(shè)計(jì)合成如下兩條引物P1和P2：

P?1：5’-CC?CGGATCC?CATATGTCTTTATCACTGATTACCC-3’；

P2：5’-CC?CTCGAG?TTACCCCTTGATCTCACTTTTATTACC-3’；

以銅綠微囊藻Microcystis?aeruginosaPCC?7806的染色體DNA為模板，P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為580bp左右，與預(yù)期大小相吻合；

3)表達(dá)載體pGEX-DUF820-2的構(gòu)建，具體方法如下：

將步驟2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物和載體pGEX-6P-1分別用BamHI和Xho?I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，然后將回收產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以Amp抗性篩選，獲得重組載體pGEX-DUF820-2。

2.核酸內(nèi)切酶DUF820-2蛋白的表達(dá)和純化方法，其特征在于其具體步驟如下：

將鑒定正確的表達(dá)載體pGEX-DUF820-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并挑單克隆到液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖培，當(dāng)培養(yǎng)液OD600達(dá)到0.7時(shí)，添加IPTG在28℃誘導(dǎo)2h培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌，離心收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體，在冰浴條件下，超聲破碎菌細(xì)胞，離心分離上清和沉淀，并通過SDS-PAGE電泳分析DUF820-2的表達(dá)，SDS-PAGE分析得到，目的蛋白在大腸桿菌BL21中以可溶形式大量表達(dá)，離心收集pGEX-DUF820-2轉(zhuǎn)化菌體，并重懸于結(jié)合緩沖液中進(jìn)行超聲破碎，破碎后菌液離心取上清液過GST?Bind?Resin柱，收集流出液；以15倍柱床體積PBS緩沖液洗柱，收集漂洗組分；3倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫并收集目的蛋白DUF820-2。將過柱純化過的蛋白緩慢裝入透析袋中，用夾子夾緊放到酶儲(chǔ)存液中，4℃緩慢搖晃24h，期間更換4～5次新的酶儲(chǔ)存液，收集透析過夜的蛋白，此即為酶液。