[發明專利]河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒和使用方法

無效

• 申請號: 201110381423.9
• 申請日: 2011-11-27
• 公開（公告）號: CN102533971A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 羅玉柱;王繼卿;劉秀;馬小軍;李少斌;王佳泰;胡江
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張真

技術領域

本發明涉及動物生物技術領域中的山羊分子標記輔助育種技術，具體涉及到河西絨山羊流產病抗性等位基因檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

羊流產病是由衣原體、弓形蟲、布魯氏桿菌感染等因素引起以羊大量流產為特征的地方性亞急性傳染病,?羊只患病后表現為流產、產弱羔、死羔等。河西絨山羊流產病發病率較高，平均流產率為25.41%，最高可達83.33%。

動物主要組織相容性（基因）復合體（major?histocompatibility?complex?，MHC）與多種疾病有密切關系，是目前開展抗病育種的首選基因座或候選基因。山羊的MHC基因的結構和功能與綿羊、牛的非常相似，并具有高度的序列同源性，分為class?I、classII和class?III區。GOLA?classII基因區域與人的結構相似，其多態性集中在Ⅱ類區域的DR和DQ基因家族，DR基因家族有A、B兩類基因座，包括1個DRA1功能基因和9個DRB基因，其中DRBl、B3、?B5是功能基因，其余是假基因。DRB1是II類區域中多態性最豐富的基因，這些多態性的產生主要由第二個外顯子編碼的氨基酸序列差異性所決定的。據顏衛華（2002年）報道，HLA與人的不明習慣性流產相關。但動物的傳染性流產病與MHC的關系還未見報道。

目前國內對山羊流產病主要采用藥物防治措施，較難控制病情且有藥物殘留風險。在國外MHC基因已經作為多種動物疾病的遺傳標記加以應用，并且多種檢測技術檢測已商業化并用來開展抗病選育。河西絨山羊流產病抗性分子選種技術主要利用PCR-SSCP技術對待測山羊的DRB1基因第2外顯子進行多態性分析，然后根據檢測結果確定攜帶不同等位基因的羊只對流產病的抗性強弱，從而判斷是否可以留作種用。

發明內容

本發明的目的是避免現有檢測技術的不足提供一種河西絨山羊流產病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒。以解決快速、敏感性高、成本低用于抗河西絨山羊流產病性分子選種技術。通過PCR-SSCP對表型正常和流產個體GOLA-DRB1基因第2外顯子進行遺傳多態性分析，并克隆、測序群體內變異產生的各等位基因序列，結合表型觀測資料，確定易感等位基因和抗性較強的等位基因，為河西絨山羊沒有感染時的抗病選育進行指導。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種河西絨山羊流產病抗性等位基因PCR-SSCP檢測試劑盒，其主要特點是包括有第一PCR反應液，第二PCR反應液，GOLA-DRB1*03和GOLA-DRB1*11的DNA標準樣；SSCP檢測試劑，去離子水，10%過硫酸銨，上樣變性緩沖液，TEMED，12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠Arc:Bis=37.5:1；

所述的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.?025%溴酚藍，0.?025%二甲苯青，10mmol/L?EDTA?pH?8.?0；

所述的第一PCR反應液的反應液：總體積20μL，其中10×buffer緩沖液為2.0μL?，Mg^2?+濃度為2.5mM，dNTPs的終濃度為??100μM，引物DRB1.1和GIo各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，模板DNA50ng，ddH₂O補充體積至20μL；

所述的第二PCR反應液的反應液：總體積20μL，其中10×buffer緩沖液為2.0μL?，Mg^2?+濃度為2.5mM，dNTPs?的終濃度為100μM，引物DRB1.1和DRB1.2各0.1μM，Taq聚合酶0.5U，稀釋10倍后的第一輪PCR產物1.0μL，ddH₂O補充體積至20μL；

引物序列為：

DRB1.1，5’-TATCCCGTCTCTGCAGCACATTTC-3’,

GIo，5’-CGTACCCAGAGTGAGTGAAGTATC-3’，

DRB1.2，5’-TCGCCGCTGCACACTGAAACTCTC-3’。

所述的GOLA-DRB1*03的DNA標準樣的核苷酸序列為：

ctggagtatc?ataagagcga?gtgtcatttc?ttcaacggga?ccgagcgggc?gcggttcctg???????60

gacagatact?tctataatgg?agaagagtac?gtgcgcttgg?acaacgactg?gggcgagttc??????120