[發明專利]一種高效表達工程菌重組蛋白的方法及應用

有效

• 申請號: 201110380864.7
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN103131724A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 丘小慶
• 申請（專利權）人: 畿晉慶三聯（北京）生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

1.一種高效表達工程菌重組蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)重組突變質粒轉染大腸桿菌pET系統工程菌中得到陽性單克隆菌落，

(2)對陽性單克隆菌落進行增菌得到種子菌液，誘導所述種子菌液大量增菌生長，

(3)分離含有表達的目的重組蛋白的菌體上清液，提純菌體上清液中的重組蛋白，

其特征在于：所述大腸桿菌pET系統工程菌指E.coli?B834(DE3)。

2.根據權利要求1所述的方法，所述大量增菌培養基為：NaCl?6.0～6.7g/L，蛋白胨25.0g/L，酵母粉7.5g/L，葡萄糖0.6～2.0g/L，Na₂HPO₄·7H₂O?6.8～18.3g/L，KH₂PO₄?3.0～4.3g/L，NH₄Cl1.0～1.4g/L，MgSO₄?0.2～0.4g/L，CaCl₂0.01g/L，甲硫氨酸0～40mg/L。

3.根據權利要求2所述的方法，所述大量增菌培養基為NaCl?6.0g/L，蛋白胨25.0g/L，酵母粉7.5g/L，葡萄糖2.0g/L，Na₂HPO₄·7H₂O?6.8g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NH₄Cl?1.0g/L，MgSO₄0.2g/L，CaCl₂0.01g/L，甲硫氨酸40mg/L。

4.根據權利要求1所述的方法，所述誘導采用熱沖擊誘導，操作方式如下：種子菌液入罐后，30℃起始生長2～3小時，測OD值達0.4-0.6時，于42℃熱沖擊30分鐘，然后將溫度下調至37℃，再生長1.5-2小時后收菌。

5.根據權利要求4所述的方法，所述熱沖擊誘導步驟中，在所述培養基中加入終濃度為0.5mM的IPTG。

6.根據權利要求1所述的方法，所述提純菌體上清液中的重組蛋白，采用CM離子交換柱，其中上樣量為上清液蛋白質量/凝膠顆粒體積為2.5mg/ml。。

7.根據權利要求1所述的方法，所述提純菌體上清液中的重組蛋白步驟中，采用CM離子交換柱，洗脫所用的NaCl濃度0.2M。

8.根據權利要求1～7任一所述的方法，所述重組突變質粒指pBHC-SA1、pBHC-SA2、pBHC-SA3?pBHC-SA4、pBHC-SE，pBHC-PA或pBHC-PorA1。

9.權利要求1～8任一所述方法在制備重組多肽PMC-SA1、PMC-SA2、PMC-SA3，PMC-SA4、PMC-SE，PMC-PA或PMC-AM中的應用。