[發(fā)明專利]一種能對目標重組蛋白進行離心法快速分離純化的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110380506.6
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102432668A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設計）人: 張光亞;陳國;林毅
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 張梧邨

技術領域

本發(fā)明涉及一種能對目標重組蛋白進行離心法快速分離純化的方法。

背景技術

近年來隨著對蛋白質的研究和生產的需要，基因重組技術突飛猛進，出現(xiàn)了很多基因工程產品，深刻地影響人類自身及其環(huán)境。而作為基因工程技術的下游工程中的基因重組蛋白的分離純化技術越來越顯示其重要性。據(jù)統(tǒng)計，基因工程產品的分離純化成本約占到其全部成本的60％～80％。因此越來越多的生物工作者從事重組蛋白的分離純化工作。

與傳統(tǒng)蛋白質分離純化方式相似，重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學性質的差異，即以分子的大小，形狀，溶解度，等電點，親疏水性以及與其它分子的親和性等性質建立起來的。當前重組蛋白質的純化主要是依靠層析和電泳技術。目前，親和標簽已成為后基因組學時代純化重組蛋白常用手段。此方法無需了解蛋白質的生化特性或生理活性，就可通過帶標簽的重組融合蛋白選擇性地與層析基質上的配體結合，從而得以純化任何蛋白質。此方法與常規(guī)的層析方法不同之處在于，針對不同的蛋白質需要開發(fā)特定的配體和方法。采用保護蛋白質結構和功能完整性的溫和條件，已成功地通過一步親和層析從粗提物中純化出了多種重組蛋白，純度達90％以上。其中6組氨酸標簽的親和層析是目前的代表。但是，此方法依然存在一些不足：如：與融合標簽結合的特異配基價格昂貴、鎳柱純化時金屬鎳離子容易脫落流出混入蛋白溶液、柱子有時會非特異性吸附蛋白質；因此，限制了在大規(guī)模分離純化中的應用。因此，發(fā)展簡單易行、廉價、可靠的重組蛋白質純化方法對于大規(guī)模生產重組蛋白及高通量蛋白質組學研究具有重要意義。

發(fā)明內容

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種能對目標重組蛋白進行離心法快速分離純化的方法。本發(fā)明通過加入一定濃度鹽誘發(fā)融合標簽蛋白發(fā)生相變聚集，通過優(yōu)化操作條件，采用離心法分離重組蛋白，效果顯著；該方法簡單、快速、高效、經濟，不需要特殊儀器，適用范圍廣、易于操作，生產成本低廉，因而適宜進行工業(yè)化生產。

為達到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種能對目標重組蛋白進行離心法快速分離純化的方法，包括如下步驟：1)通過融合標簽蛋白基因上的限制性酶切位點，將目標蛋白基因與融合標簽蛋白基因連接，并導入到宿主菌中；2)使用不同鹽離子及相應的濃度的緩沖溶液，在特定pH值中，通過控制溶液溫度使融合標簽蛋白發(fā)生相變聚集得到蛋白質溶液；3)對蛋白質溶液通過離心法純化目標蛋白。

所述的一種能對環(huán)境條件敏感的融合標簽蛋白及其基因，其命名為[KV8F]n，其中n為重復數(shù)，其數(shù)值在1-1000之間，該序列已進行菌種專利保藏(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC?NO.4185，保藏日期：2010年9月17日)并申請了專利(專利申請?zhí)枺?01010562100.5)。

所述的步驟1)中限制性內切酶采用ApaI、BglII、KpnI、NheI、SphI、XbaI、SacI、Nde?I、Sfi?I、EcoR?I、pflMI、Hind?III和Xho?I中的一種或多種；限制性內切酶與融合標簽蛋白基因相連接；或者在目標蛋白與融合標簽蛋白基因間加入一段無規(guī)則結構的序列，然后插入到表達載體中，進一步轉化到大腸桿菌BL21(DE3)或者BLR菌株中(二者均為商業(yè)化菌株，可直接從上海超研生物科技有限公司、上海博亞生物科技有限公司購買)，篩選出陽性轉化子，陽性轉化子經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導使編碼基因(購于Sigma公司)獲得融合高效表達，然后進行細胞破碎。

所述的無規(guī)則結構的序列為：(AGAGAGPEG)_n，n的取值范圍在1-150。