[發明專利]一株產丁二酸基因工程菌及其發酵生產丁二酸的方法

有效

• 申請號: 201110380396.3
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102399738A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 姜岷;劉嶸明;梁麗亞;馬江鋒;陳可泉;韋萍
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 樊文紅

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一株產丁二酸基因工程菌及其發酵生產丁二酸的方法，具體是一株高效利用木糖生長并產丁二酸重組菌株及其利用該菌株發酵生產丁二酸的方法。

背景技術

丁二酸（succinic?acid）又稱琥珀酸，被廣泛應用于醫藥、農藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業，作為C4平臺化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內酯等有機化學品以及聚丁二酸丁二醇酯?(PBS)?類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來12種最有價值的生物煉制產品之一。

丁二酸的生產方法主要包括化學合成法和微生物發酵法，利用微生物發酵法轉化可再生資源（葡萄糖、木糖等），由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環境友好，且在發酵過程中可以吸收固定CO₂，能有效緩解溫室效應，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來成為研究的熱點。丁二酸的生產菌株主要集中在Anaerobiospirillum?succiniciproducens、Actinobacillus?succinogenes、Mannheimia?succiniciproducens、重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。利用野生菌株生產丁二酸雖然獲得了較高的產物濃度，但培養過程培養基成本較高，且甲酸、乙酸等副產物積累較多，阻礙了其工業化進程。E.coli?由于遺傳背景清楚、易操作、易調控、培養基要求簡單和生長迅速等優點，近年來被廣泛用于研究以獲得產丁二酸優秀菌株。

野生菌株生產丁二酸雖然獲得了較高的產物濃度，但培養過程培養基成本較高，且甲酸、乙酸等副產物積累較多，因此大腸桿菌敲除或失活乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性減少副產物的生成，但是由于敲除丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，導致菌株不能生產乙酸，從而使伴隨乙酸生成的ATP減少，最終導致重組大腸桿菌不能利用木糖代謝生長，并且生產丁二酸。

玉米芯是農業生產中比較常見的廢棄物，由于其成分含有大量纖維素，因此其水解液對微生物發酵來說，是一種很好的可持續利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現有技術中大多數產丁二酸大腸桿菌不能利用玉米芯水解液發酵生產丁二酸。姜岷等將玉米芯按料液比1:5?(質量體積比)配制玉米芯料液，物料粒徑250～380μm，H₂SO₄用量3%?(體積分數)，水解溫度126℃，反應時間215?h，利用活性炭吸附及Ca(OH)₂中和等方式，對玉米芯多組分糖液進行脫毒脫鹽處理，總糖質量濃度為50?g/L，其中木糖占80%以上。

稻草秸稈是重要的一類可再生生物質資源。目前，除了在造紙業工業方面的利用，絕大多數被廢棄，嚴重浪費了資源并且污染了環境。其主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，因此其水解液對微生物發酵來說，是一種很好的可持續利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現有技術中大多數產丁二酸大腸桿菌不能利用稻草秸稈水解液發酵生產丁二酸，陶文沂等通過稀硫酸121℃處理稻草秸稈1?h，再用20?g/L的NaOH于121℃處理秸稈1h，葡萄糖和木糖二者總質量濃度都達50?g/L左右。

甘蔗渣是甘蔗制糖時榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液對微生物發酵來說，是一種很好的可持續利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此現有技術中大多數產丁二酸大腸桿菌不能利用稻草秸稈水解液發酵生產丁二酸，約含有50%的纖維素通過粉碎以及堿/氧化法預處理可得到總糖質量為50?g/L，其中木糖占80%以上。

在大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此過程中沒有ATP的生成，但是在Bacillus?subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此過程中有ATP的生成，并且Millard等在大腸桿菌中過量表達E.?coli?ppc和pck，研究發現過量表達ppc可以使琥珀酸作為混合酸發酵的主要產物,?且產量較出發菌株提高3.5倍，而過量表達pck對發酵結果沒有影響，但在ppc缺陷菌株中，pck的過量表達能夠提高琥珀酸的產量。

發明內容