[發明專利]人腦組織特異性基因LRRC4單抗及其制備和應用方法

無效

• 申請號: 201110379570.2
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102443062A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 李桂源;李丹;武明花;陳攀;王蓉;李小玲;唐海林;王澤友
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07K14/47;C12N15/12;C12N15/70;G01N33/577;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及人腦組織特異性基因LRRC4單抗及其制備和應用方法，屬于基因工程領域。

背景技術

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，約占中樞神經系統原發性腫瘤的40-50％，綜合發病年齡高峰在30-40歲，或10-20歲，具有發病率高、復發率高、死亡率高及治愈率低等特點。由于膠質瘤呈“樹根狀”浸潤性生長，與周邊正常腦組織無明顯分界，僅通過手術治療難以達到完全根除，常聯合放、化療及免疫治療等方案。盡管如此，膠質瘤細胞增殖快、易侵襲，以至于它能有效地“逃脫”上述治療方案，最終導致患者死亡。雖然目前隨著生命科學研究的發展，膠質瘤的診斷和治療方法在不斷改進，但其中位生存期仍沒有明顯提高，尤其是膠質母細胞瘤，其中位生存期僅為9-12個月，而間變性星形細胞瘤其中位生存期也僅為3年。因此，尋求新的治療途徑和方法，例如靶向治療、基因治療等成為熱門研究領域。

我們前期運用EST介導的定位候選克隆策略，從多種腫瘤高頻缺失區7q31-32克隆了一LRR超家族新成員LRRC4，該基因編碼一種跨膜蛋白，其胞外區包含9.5個LRR結構域。研究發現LRRC4在正常人腦組織中相對特異高表達，而在多種原發性腦瘤中表達明顯下調甚至缺失，尤其是膠質瘤。(王潔如，錢駿，董利，李小玲，譚琛，李江，張必成，周潔，李桂源.富亮氨酸重復超家族新成員LRRC4的克隆與在腦瘤中的表達分析.生物化學與生物物理進展.2002，29(2)：233-239.)進一步研究發現，LRRC4能通過MAPK信號通路抑制膠質母細胞瘤細胞系U251的生長和成瘤潛能，是一個新的候選抑瘤基因。為深入研究LRRC4的生物學功能，尋找與其直接作用的交互蛋白，明確其所參與的具體信號轉導通路，制備高效特異的抗LRRC4抗體是非常必要的。

申請人在前期工作中發現，LRRC4全長蛋白整體親水性不高，經多次嘗試難以誘導其表達，選擇親水性好、抗原指數高且序列特異的一段多肽作為動物的免疫原不失為一種好的方法。His標簽是由6個組氨酸構成的短肽，專門設計用于重組蛋白的表達純化，His標簽與其它標簽相比具有很多明顯優勢：①對金屬離子(如鎳、鈷)有高度的選擇性和親和力；②與金屬離子的結合不受變性劑(如尿素、胍)的影響；③溫和多樣的洗脫條件。因此，選擇LRRC4基因編碼區中特定的一段核苷酸序列，利用His標簽建立一個基于融合蛋白的高效的蛋白表達和純化系統，是本發明的工作基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供高效特異的抗人腦組織特異性基因LRRC4的單抗及其制備和應用方法。

本發明單抗的制備方法如下：應用DNASTAR軟件分析LRRC4(Genebank?ID：64101)全長蛋白的親水性、抗原指數及表位可能性等，并結合NCBI數據庫中的Protein?Blast進行序列特異性分析，選取其第460-521位，長度為62個氨基酸，序列為ETTEISPEDTTRKYKPVPTTSTGYQPAYTTSTTVLIQTTRVPKQVAVPATDTTDKMQTSLDE，的多肽作為動物的免疫原。

首先應用多聚酶鏈式反應克隆編碼該多肽的核苷酸序列，構建包含該核苷酸序列的His融合表達載體，轉入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導His融合蛋白表達，Ni柱親和純化后免疫Balb/c小鼠，然后分離其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，經陽性克隆篩選及亞克隆化后制備腹水，辛酸-硫酸銨沉淀法純化獲得抗LRRC4單抗。應用該抗體進行western?blot及細胞免疫熒光實驗，均顯示出該抗體的特異性和高效價。

一種人腦組織特異性基因LRRC4單抗是由上述的方法制備而成的單抗。

一種人腦組織特異性基因LRRC4單抗用于制備診斷和治療膠質瘤的藥物或試劑。

應用本發明抗體可深入研究LRRC4的生物學功能，明確其所參與的具體信號轉導通路，有助于進一步闡明膠質瘤發生發展的機制。此外，由于LRRC4在正常人腦組織與膠質瘤組織中的表達水平存在明顯差異，因此抗LRRC4單抗在膠質瘤的早期診斷和治療方面具有潛在的應用價值。

附圖說明

圖1：DNASTAR軟件分析LRRC4全長蛋白的特性；

圖2：His融合表達質粒的酶切鑒定；(M1、M2：DNAMarker；1：His融合表達質粒)

圖3：His融合蛋白的誘導表達；

圖4：應用抗LRRC4單抗進行Western?blot，檢測LRRC4蛋白的表達水平；

圖5：應用抗LRRC4單抗進行細胞免疫熒光實驗，檢測LRRC4蛋白的細胞定位。