[發明專利]三種芒果象甲快速鑒定的特異性引物及其檢測方法

無效

• 申請號: 201110379136.4
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102409097A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 馬光昌;黃武仁;符悅冠;彭正強;張方平;牛黎明;韓冬銀;馬叢林;胡好遠
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
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技術領域

本發明屬于應用生物技術領域，具體地說涉及應用于危害芒果果實的三種象甲的分子鑒定的特異引物及其快速鑒定方法。

背景技術

芒果在我國種植已有幾百年的歷史，近年來，芒果種植業迅速發展，已在云南、海南、廣西、廣東、福建等地大面積種植，成為熱帶的主要水果之一，同時也可作為城市綠化的主要樹種。芒果象甲類Sternochetus?spp.是芒果生產栽培中危險性的害蟲。芒果象甲隸屬于鞘翅目Coleoptera，象蟲科Curculionidae，隱喙象亞科Cryptorhynchinae，洞腹象屬Sternochetus。該屬有3種象甲可危害果，其中危害果核的有芒果果核象甲(S.mangiferae?Fabricius)和芒果果實象甲(S.olivieri?Faust)；危害果肉的有芒果果肉象甲(S.frigidus?Fabricius)，它們都是芒果的主要害蟲，已被我國列為對外進境植物檢疫二類危險性的害蟲，能使芒果被害率達30-80％，嚴重影響了芒果的產量和品質。隨著我國對外貿易交往日益頻繁，芒果象甲隨水果進入的機率大大增加，為防止其對芒果產業再次造成巨大的經濟損失，有效地避免芒果象甲隨入境果進入傳播、擴散和危害，加強對三種象甲的識別鑒定與檢疫尤為重要。

目前，對芒果象甲的鑒定主要從體形大小、觸角形態及構造、前胸背板中隆線的明顯與否、鞘翅斜帶的寬窄、奇數行間鱗片瘤的大小和有無等特征為依據。但傳統的方法很難對芒果象甲的幼蟲或殘缺個體進行鑒別。近年來分子生物學技術發展迅速，基于PCR技術的分子鑒定為物種的鑒定提供了新的手段，彌補了傳統形態鑒定的諸多不足。利用分子標記鑒定物種已有不少的嘗試，如Ward等(2005)完成了對澳大利亞207種魚類的分子編碼，同年，Ball和Hebert(2005)嘗試用分子條碼鑒定70多種水生昆蟲蜉蝣(蜉蝣目，Ephemeroptera)。PCR技術以生物基因組DNA為檢測依據，具有檢測周期短和不受靶物種的形態、性狀等方面影響的優點，非常適合芒果象甲等一些檢疫性害蟲未成熟蟲態的快速檢疫鑒定。本文通過對三種芒果象甲基因序列的分析，設計并篩選出了能特異性擴增三種芒果象甲基因片段的引物，完成了對三種芒果象甲的PCR快速準確鑒定。

發明內容

本發明的目的是針對從形態上難以鑒定的三種芒果象甲，利用分子標記手段，分別設計三種象甲的特異性引物，創建了高度準確可靠、易于操作的芒果象甲的檢測和快速鑒定方法。該方法可以直接應用于生產實踐，對于芒果象甲的鑒定和檢疫具有十分重要的意義。

本發明的技術方案如下：

1.提取三種芒果象甲的基因組DNA，利用Internal?Transcribed?Spacer?Regions?1(ITS1)通用引物進行PCR擴增，通過克隆測序得到三種芒果象甲的ITS1序列。

2.對獲得的三種芒果象甲的序列進行比對分析，分別找到三種芒果象甲的特異區域，利用Oligo?6.0軟件，在這些區域設計三種芒果象甲的特異引物。

3.對新設計的特異引物進行溫度、Mg²⁺等條件的優化，使之能更加準確的擴增出目的片段。從而達到快速，準確鑒定三種芒果象甲的目的。

4.對擴增出的目的片段進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用DNA?Marker-DL2000檢測PCR片段大小。

5.鑒定結果的判斷：根據電泳顯示的PCR擴增片段的大小來判斷，若有明顯清晰的370bp左右的條帶，則可判斷為是芒果果肉象甲，若條帶為790bp左右的為芒果果核象甲，若條帶為210bp左右的則為芒果果實象甲。

本發明的效果是：結合PCR技術手段的鑒定方法，可以給非傳統分類的專業人士，提供準確快速鑒定三種芒果象甲的技術，從而為芒果象甲的防治以及檢疫做出貢獻。

附圖說明

圖1為用SF-F/SF-R特異性引物鑒別芒果果肉象甲結果，其中M為DNA?Marker，X1，X2，X3為芒果果肉象甲S.frigidus?X4，X5，X6為芒果果核象甲S.mangiferae；X7，X8，X9為芒果果實象甲S.olivieri。

圖2為用SO-F/SO-R特異性引物鑒別芒果果實象甲結果，其中M為DNA?Marker，X1，X2，X3為芒果果肉象甲S.frigidus；X4，X5，X6為芒果果核象甲S.mangiferae；X7，X8，X9為芒果果實象甲S.olivieri。