[發(fā)明專利]用于鼠源RNA病毒多重實(shí)時熒光PCR檢測的引物、探針及其試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110379134.5
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102367494A
• 公開（公告）日: 2012-03-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚淑萍;李萃;王剛;蔣立新;周志文
• 申請（專利權(quán)）人: 舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測鼠源RNA病毒多重實(shí)時熒光PCR檢測的引物、探針及其試劑盒、方法。

背景技術(shù)

自然感染實(shí)驗(yàn)動物的病毒很多，根據(jù)對人類的危害性，可將其分為三類；一類為人獸共患病病毒，能夠感染人與靈長類動物；二類目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養(yǎng)的人、猿和猴源性細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制，對人類有潛在危險性；三類病毒在自然條件下僅感染動物本身，目前尚無跡象表明能夠感染人，因此對人類威脅不大。

現(xiàn)今，小鼠作為單克隆抗體、蛋白類藥物等生物制品的一個主要來源，具有潛在的病毒污染。在《中華人民共和國藥典(2010年版)》三部中，規(guī)定了鼠源性生物制品需質(zhì)檢的8種鼠源病毒，其中鼠源RNA病毒有6種，分別為小鼠肺炎病毒(Pneumonia?Virus?of?Mice，PVM)、漢坦病毒(Hantaan?virus，HTNV)、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(Lymphocytic?Choriomeningitis?Virus，LCMV)、呼腸孤病毒III型(Reovirus?3，Reo3)、仙臺病毒(Sendai?virus，SEV)、小鼠白血病病毒(Murine?leukemia?virus，簡稱MuLV或MLV)，這些病毒屬于一類或二類，為人畜共患病毒或?qū)θ祟愑袧撛谖ｋU性。鼠源性病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定對客觀評價生物制品質(zhì)量，確保人民健康必將起到積極的作用。

藥典規(guī)定的鼠源病毒檢測方法有：細(xì)胞試驗(yàn)、動物抗體產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)和雞胚感染實(shí)驗(yàn)。這些方法從生物效應(yīng)角度來檢測鼠源病毒的潛在污染，檢測手段復(fù)雜費(fèi)時，周期長，且對操作的實(shí)驗(yàn)室有一定要求，不宜作為一種常規(guī)的指導(dǎo)生產(chǎn)的質(zhì)控手段。

而目前發(fā)展十分成熟的實(shí)時熒光PCR技術(shù)(Real-time?Fluorence?Polymerase?Chain?Reaction簡稱Real?Time?PCR)檢測靈敏度高，簡單方便，且對實(shí)驗(yàn)室要求也很低。Real?Time?PCR于1996年由美國Applied?biosystems公司推出，是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(or?cDNA)的起始濃度進(jìn)行定性定量分析的方法。該方法自產(chǎn)生以來，不斷發(fā)展完善，特別是隨著Taqman熒光探針的廣泛應(yīng)用，到目前為止該技術(shù)已經(jīng)非常成熟。Taqman熒光探針的PCR檢測是指進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，在反應(yīng)體系中加入一對引物的同時還加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基因和一個淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時，報告基因所發(fā)射的熒光信號被淬滅基因吸收，擴(kuò)增時隨著Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5’-3’外切核酸酶活性將探針酶切降解，報告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光檢測系統(tǒng)可以監(jiān)測到熒光信號，模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一關(guān)系，所以信號累積與PCR產(chǎn)物完全同步。整個反應(yīng)結(jié)束后，便可得到一條擴(kuò)增曲線，由已知濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增曲線可以得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品中的擴(kuò)增曲線可對樣品進(jìn)行定性定量分析。

實(shí)時熒光PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定性或定量，而且具有靈敏度和特異性高、自動化程度高、無污染、實(shí)時和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該已被廣泛用于免疫分析、細(xì)菌、病毒檢測等多個領(lǐng)域。但迄今為止，使用多重實(shí)時熒光PCR技術(shù)同時對6種常見鼠源RNA病毒進(jìn)行檢測方面還未見有報道，同時檢測多種病毒更經(jīng)濟(jì)、省力、快速。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有鼠源病毒檢測方法的不足，本發(fā)明提供了一種多重實(shí)時熒光PCR檢測鼠源RNA病毒的引物、探針及其試劑盒，該方法簡單方便、更經(jīng)濟(jì)、省力，靈敏度高且大大節(jié)約了檢測時間。

本發(fā)明的一個目的是提供一種用于鼠源RNA病毒多重實(shí)時熒光PCR檢測的引物，其中，所述引物選自特異性地擴(kuò)增小鼠肺炎病毒、漢灘病毒、漢城病毒、普馬拉病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、呼腸孤病毒III型、仙臺病毒和小鼠白血病病毒的專用引物中的兩種或兩種以上，

其中，

特異性地擴(kuò)增小鼠肺炎病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ?IDNO：1的上游引物與具有序列表中的SEQ?ID?NO：2的下游引物組成的一對寡核苷酸；

特異性地擴(kuò)增漢灘病毒的專用引物是由具有序列表中的SEQ?IDNO：3的上游引物與具有序列表中的SEQ?ID?NO：4的下游引物組成的一對寡核苷酸；