[發(fā)明專利]一種微量、復(fù)雜DNA的擴增方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110378904.4
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN103131694A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘星華;蔡勇平
• 申請（專利權(quán)）人: 上海綠宇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司 31213
• 代理人: 王敏杰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微量、復(fù)雜DNA的擴增方法，尤其涉及一種微量DNA、或者單細胞或微量細胞全基因組DNA的高靈敏、高保真、高均一、高效率的擴增技術(shù)，以及海藻糖在所述全基因組DNA擴增中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

微量模板DNA的檢測，是很多領(lǐng)域迫切需要解決的一個難題。因為DNA量不足，用現(xiàn)有的技術(shù)手段常無法檢測成功。PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用使得微量甚至單個細胞的DNA分析成為可能，極大地促進了法醫(yī)學(xué)、古生物學(xué)、分子診斷學(xué)和分子病理學(xué)的發(fā)展。但即便是對于非常敏感的PCR技術(shù)，許多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或幾次PCR反應(yīng)。另一方面，PCR特長于特定的較短的（一般數(shù)千堿基對kbs以下）而且單一的特定DNA序列，PCR在復(fù)雜DNA、尤其是長片斷的復(fù)雜DNA全庫（全譜）擴增方面有諸多的先天不足。為能從少量細胞中最大限度的獲取信息，全基因組擴增技術(shù)應(yīng)運而生。

全基因組擴增技術(shù)（WGA）是一組對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術(shù)，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量，可對非常微量的DNA進行均衡的擴增獲得大量DNA，故被認為是目前解決這一難題的一種基本方法，已被廣泛用于法醫(yī)學(xué)、單基因遺傳病的診斷及疾病基因的分析等領(lǐng)域研究。

單細胞基因組學(xué)是包括單細胞全基因組測序，和以單細胞和微量細胞為材料的全基因組范圍內(nèi)的基因功能(功能基因組學(xué))研究技術(shù)，這些技術(shù)的完善一方面為細胞水平的生命功能研究提供了基礎(chǔ)，另一方面也成為下一代基因水平疾病診斷和治療的方法與技術(shù)的基礎(chǔ)。

單細胞和微量細胞WGA是單細胞全基因組學(xué)的前提與基礎(chǔ)，而擴增效率和保真性是衡量WGA技術(shù)優(yōu)劣的主要指標(biāo)。多重置換擴增（multiple?displacement?amplification，MDA）和滾環(huán)擴增(Rolling?cycle?amplification，RCA)是一種擴增效率高、保真性能好的新興WGA?技術(shù)。該技術(shù)一般利用phi29?DNA聚合酶和六聚體隨機引物對基因組進行擴增，在28~30?℃條件下恒溫即可反應(yīng)。擴增時，六堿基隨機引物在多個位點與模板DNA退火，在phi29?DNA聚合酶的作用下同時開始復(fù)制，其沿著模板合成DNA，同時取代模板的互補鏈。被置換的互補鏈又作為新的模板進行擴增，最終可獲得大量的DNA。MDA和RCA技術(shù)的優(yōu)點主要包括：①擴增高效性和高保真性；②產(chǎn)量穩(wěn)定性；③擴增產(chǎn)物長度有保障；④應(yīng)用方便、快捷。MDA/RCA最先被用于人類全基因擴增，此后廣泛應(yīng)用于真核細胞的研究，包括基因組測序和基因分型、腫瘤學(xué)研究和臨床應(yīng)用等，而且近年來，MDA/RCA技術(shù)在擴增經(jīng)過預(yù)先處理的DNA?(功能基因組學(xué)相關(guān)的DNA)方面的潛力也已被人們發(fā)覺。

但是MDA/RCA技術(shù)也存在一些問題，雖然具有高度的擴增效率和保真性，但用于單細胞擴增時仍存在缺陷，影響了其在研究和臨床上的推廣應(yīng)用，主要包括以下幾方面：①易產(chǎn)生擴增偏差；②易發(fā)生選擇性擴增或等位基因脫扣現(xiàn)象，而等位基因選擇性擴增（Preferential?Amplification，PA）和等位基因脫扣（Allele?Drop?Out，ADO）是單細胞PCR過程常見的問題，也是引起誤診的關(guān)鍵；③常發(fā)生微衛(wèi)星異常擴增或丟失；④易污染或非特異性擴增，由于MDA/RCA敏感性高，極少量的污染都會造成擴增失敗。基于上述原因，現(xiàn)在MDA/RCA技術(shù)并沒有大量普及使用。

發(fā)明內(nèi)容

針對MDA/RCA技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種針對微量、復(fù)雜DNA的高靈敏、高保真、高均一、高效率的擴增方法,?該擴增方法在微量、復(fù)雜DNA?庫(譜)的擴增方面，擴增產(chǎn)物具有高忠實性、高特異性、高敏感性，并且能夠保持不同序列的平衡擴增。

本發(fā)明第一個目的是提供一種海藻糖在微量、復(fù)雜DNA擴增中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的海藻糖在全基因組DNA擴增中的應(yīng)用，海藻糖以高濃度加入到擴增反應(yīng)體系中，與DNA聚合酶（包括phi29?DNA聚合酶及由其改造而來的衍生DNA聚合酶或替代酶）作用，能夠有效抑制非特異性擴增，使整合DNA庫不同序列的DNA的擴增能夠均一和平衡。

海藻糖在所述微量、復(fù)雜DNA擴增反應(yīng)體系中的濃度優(yōu)選為0.1mol/L~1mol/L。

本發(fā)明第二個目的是提供一種使用所述海藻糖進行微量、復(fù)雜DNA擴增的方法。加入含有海藻糖的DNA擴增反應(yīng)體系、和DNA聚合酶（包括phi29?DNA聚合酶及由其改造而來的衍生DNA聚合酶或替代酶），27～42℃保溫反應(yīng)。