[發明專利]培養肝臟干細胞的方法

無效

• 申請號: 201110378651.0
• 申請日: 2011-11-24
• 公開（公告）號: CN102399744A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 畢薇薇
• 申請（專利權）人: 吉林省拓華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 王淳

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體來說，是一種提取并擴增肝臟干細胞的方法。

背景技術

以往，肝癌及晚期肝硬化的終末期治療為肝移植，但供體來源緊缺且移植后不良反應較多。干細胞移植技術應用于臨床后，給廣大患者帶來了生存的希望。最初，臨床應用的是自體骨髓干細胞，但骨髓質量受患者年齡，身體狀態等條件影響，往往使得干細胞數量及活性減弱。

目前，利用早期(流產)胎兒的組織干細胞治療相關疾病已進入臨床。2003年科學技術部、衛生部印發的《人胚胎干細胞研究倫理指導原則》指出，在知情同意的原則下，允許使用自然或自愿選擇流產的胎兒細胞。這為利用流產胎兒的組織細胞進行干細胞培養和研究的合法性提供了依據。

現有技術中，已有利用流產胎兒的肝臟組織培養肝臟干細胞，用于治療肝硬化及糖尿病的先例，并取得了良好療效。

現有的肝臟干細胞的培養方法，包括雙酶消化法，灌注法，差速離心法，篩網過濾等。

雙酶消化法及灌注法，是使用兩種酶分階段消化肝組織、或向肝組織中灌注，使干細胞從組織中分離出來。此種方法處理肝組織的時間長、處理步驟多，易造成污染和對細胞損傷。差速離心法，是不用消化酶而是組織剪碎后通過不同速度剔除組織碎片留下細胞，但這種方法混有的紅細胞較多，培養使影響肝臟干細胞的貼壁和生長。

發明內容

本發明的主要目的在于，針對現有技術中培養肝臟干細胞的方法存在處理組織時間長、細胞損傷大及混雜細胞多等不足，提供一種提取時間短、培養質量高的肝臟干細胞的培養方法，以增強肝臟干細胞治療疾病的療效。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種培養肝臟干細胞的方法，其步驟如下：

a.在無菌條件下，取經提供者自愿捐獻并知情同意、且肝炎病毒標志物、梅毒、HIV檢測均為陰性的流產胎兒的肝臟組織，用含有雙抗的PBS(Phosphate?Buffered?Saline，磷酸鹽緩沖液)沖洗3遍；

b.將肝臟組織剪碎，用0.25％g/mL的胰蛋白酶溶液(可以是水溶液或PBS溶液)，消化30分鐘；

c.用完全培養基中和消化液；

d.將經過步驟b消化和步驟c中和后的肝臟組織在消化液和中和液的混合液體中吹打混勻，以500轉/分鐘離心5分鐘，取上層清液，之后再以1500轉/分鐘離心5分鐘；

e.棄去上層清液，將沉淀用完全培養基懸起，接種于培養瓶中，在37℃下、5％CO₂的環境中培養；

f.培養4天后，洗去未貼壁的細胞，用完全培養基進行換液；

g.每隔4天用完全培養基換一次液，待細胞生長擴增達到占培養瓶底面積80％以上，1∶2傳代，即由一瓶分裝至兩瓶，當每瓶細胞又擴增達到占培養瓶底面積80％以上時，再分別傳代，以此類推。

其中，所述雙抗為在PBS中的終濃度為1％g/mL的青霉素和1％g/mL的鏈霉素。

其中，所述完全培養基為含10wt％胎牛血清的α-MEM培養基。

其中，在步驟g的傳代操作之前，將細胞用胰蛋白酶-EDTA(Ethylene?Diamine?Tetraacetic?Acid，乙二胺四乙酸)混合液消化。

所述的胰蛋白酶-EDTA的混合液是由0.25％g/mL的胰蛋白酶和0.02wt％EDTA以1∶1的體積比混合得到的。

本發明的有益效果是：

本發明有益效果在于，應用本發明的技術方案對胚胎肝臟干細胞進行分離培養，細胞活力好，原代組織處理時間及步驟縮短，減少污染機會及對組織細胞的損傷。接種后細胞增殖較快，傳代細胞生長較好。經過形態學觀察及流式細胞術等檢測均符合干細胞特性。本發明方法適用于大量培養用于肝臟疾病的干細胞治療。顯示出本發明的分離培養方法相對于現有技術具有顯著的進步。

附圖說明

圖1為采用本發明方法進行培養的細胞原代培養至第3天的形態學觀察照片。

圖2為采用本發明方法進行培養的細胞原代培養至第11天的形態學觀察照片。

圖3為采用本發明方法進行培養的細胞傳代培養至第5代的形態學觀察照片。

圖4為采用本發明方法培養的肝臟干細胞的生長曲線。

圖5為采用本發明方法培養的肝臟干細胞表面抗原標志的流式細胞術檢測結果。

圖6為采用本發明方法培養的肝臟干細胞體外成骨誘導的堿性磷酸酶染色檢測結果。

具體實施方式