[發明專利]EGF修飾的PAMAM自組裝轉基因組合物及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201110378349.5
• 申請日: 2011-11-24
• 公開（公告）號: CN102517332A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 郝艷麗;張小寧;劉楠;殷哲
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;A61K48/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及EGF修飾的PAMAM自組裝轉基因組合物及其制備方法與應用。

背景技術

新興的基因治療手段是通過將外源基因片段轉入細胞內部，調控基因表達以糾正人自身基因的結構或功能上的錯亂，阻止病變的進展，殺滅病變的細胞，或抑制外源病原體遺傳物質的復制，從而達到治療的目的。由于基因治療可以跨越傳統治療手段的瓶頸，因此成為重大惡性疾病治療領域(例如癌癥、重大惡性傳染病、遺傳類疾病)的前沿和熱點。

然而，由于基因治療藥物自身的特性使基因表達水平受限：1)基因治療藥物因攜帶負電荷無法跨越表面同樣帶負電荷的細胞膜；2)在體內遞送的過程中不穩定極易被降解；3)易被非特異性免疫清除；4)體內遞送的非靶向性等。由此可見，當前體內基因治療能夠成功并實現臨床轉化應用的關鍵是如何將基因治療藥物高效地在體內進行遞送并實現其胞內功效，而解決這些問題的關鍵是設計構建合適的基因治療藥物載體系統。

利用納米技術制備的藥物載體顆粒具有比表面積大、尺寸小、表面易修飾等特點，因此，將納米顆粒包載基因治療藥物后用于重大惡性疾病的治療正成為基因治療藥物研究的新方向。以納米顆粒作為基因遞送載體，將DNA和RNA等治療性基因片段包裹在納米顆粒之中或者吸附在顆粒表面，同時利用顆粒表面偶聯特異性的靶向分子，如特異性配體、單克隆抗體等通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，或納米材料自身的特殊物理化學性質，如磁性、光學性能、被動靶向性等，在細胞攝取作用下進入細胞內，實現安全有效的靶向性基因治療[Proc?28th?Int?Symp?on?Contr?Rel?of?Bioact?Mater，2001，7095]。

新型樹枝狀高分子聚酰胺-胺(PAMAM)，以其獨特的分子結構和表面性質，成為了治療性基因載體研究的熱點。以末端為胺基的PAMAM樹枝狀大分子為例，它在生理pH條件下具有很好的溶解性；由于能夠通過其所帶的陽離子和DNA所帶的陰離子的靜電相互作用，不但可以實現更多數量基因的運載，提高轉染效率；而且體系穩定，非常適合作為DNA的載體，能有效地在不同的細胞類型間轉移遺傳物質；可介導外源基因在宿主細胞染色體DNA中的整合，從而獲得轉基因的長期、穩定表達；能夠保護目的基因不受體內血漿或組織細胞中各種酶的破壞，因而可以實現體內的有效轉染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：4897-4902]。

眾多研究表明，PAMAM納米基因遞送系統在體外轉染中表現良好的應用前景，但PAMAM作為納米基因遞送載體在體內應用尚存在以下幾個問題需要解決：1)轉染效率相對較低；2)在體內環境下，PAMAM可以非特異性的結合大量的負電大分子和紅細胞，影響轉染效率并且發生溶血現象；3)如何實現PAMAM納米基因遞送系統的靶向性。

為了解決上述問題，目前研究多直接在PAMAM分子上進行修飾，如在PAMAM表面修飾鳥氨酸等殘基[Int?J?Pharm，2010，392：294-303]，增強PAMAM分子表面正電性以增強轉染效率，但此方法在增強過多正電性的同時，也提高了細胞毒性；另一方面，對PAMAM表面修飾PEG[Nanotechnology，2009，20：105103]，以提高生物相容性，減少非特異性的結合血漿中的負電大分子和紅細胞，另外，在PEG末端修飾特定蛋白如乳鐵蛋白[Biomaterials，2008，29(2)：238-246]，以實現組織靶向性，但PEG的修飾增加了PAMAM分子和DNA分子結合的空間位阻，降低了轉染效率。

EGFR是一種酪氨酸激酶受體，在細胞周期中起重要作用，與細胞生長、增殖、遷移有關。其編碼基因是一種原癌基因，在生理狀態下它不表達或只是有限制的表達，處于非激活狀態，不具有致癌性。如果編碼該受體的基因發生突變，將會導致多余的表面生長因子受體產生，增強了細胞信號的傳導，便容易誘發腫瘤。EGFR的過度活化與腫瘤生長和分級(包括增殖、血管發生、浸潤和轉移)的關鍵過程有關。研究表明EGFR的過量表達和/或突變可以導致多種腫瘤發生，眾多的人類實體瘤如頭頸癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、子宮及腦部腫瘤等，都存在EGFR過表達現象。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于轉基因的組合物。

本發明所提供的用于轉基因的組合物，由末端帶有氨基的聚酰胺-胺樹枝狀聚合物、表皮細胞生長因子和核酸復合制成。

所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物的數均分子量為6909-28826。

所述聚酰胺-胺樹枝狀聚合物的正電荷與所述核酸的負電荷的比值為1∶1-20∶1。